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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划半定量rt-pcr试验心得半定量PCR：方法一：一总RNA提取1.将新鲜的悬浮培养细胞(25ml)倒进离心管中，8000g4离心10min,弃上清；2.加液氮研磨一次，按108个细胞加1mltrizol，用枪反复吹吸至裂解液无明显沉淀，室温静置10min；3.加200l氯仿，剧烈震荡20s，室温放置5-10min；4.取上层水相，一般取400l足够；5.加入等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min；g离心10min；7.75%乙醇1ml洗涤沉淀；g离心5min；9.弃乙醇，短暂离心，吸
2、干净残余乙醇，室温干燥3-5min;10.用20ldepc水溶解沉淀；11.电泳：110V，10-15min。(2%琼脂糖胶)半定量PCR二基因组DNA的去除RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNaseI(RNaseFree)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm，计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5l，2琼脂糖凝胶，110v电压，l0min电泳后拍照。三第一条链cDNA合成冰上按以下次序配置体系TotalRNAgPrimer(randomhexamerprimer)1LWater,nuclease-free
3、合计12L将体系轻柔混合短暂离心后，在PCR仪进行以下程序：65，5min后4，5min；顺次加5Reactionbuffer4LRnaseinhibitor(20u/L)1L10MmdNTPMix2LReverseTranscriptase(200u/L)1L将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序：25，5min；42，60min；70，5min。四.内参基因和目的基因引物设计内参基因需是看家基因，目的基因要求PCR产物在350-800bp之间，且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。五.内参基因和目的基因退火温度的确定进行不同的变性温度梯度PCR，内参基因和目的基因分管做，PC
4、R结束后进行琼脂糖凝胶电泳六.PCR循环数的确定按普通PCR循环，设定为34个循环，内参基因和目的和目的基因分管作，内参和目的基因都做6管，在PCR的第18、20、22、24、36、28、30、32、34个循环各拿出1管，一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。七.半定量PCR采用以上优化好的RT-PCR条件进行PCR上面的是提RNA的方法是提细菌的总RNA,酵母菌也适用，提真核细胞的总RNA还可以用酸性酚法提，效果很不错方法二：半定量反转录聚合酶链反应是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PC
5、R产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。这种方法不另设内标准,排除了2对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量效益关系和良好的重复性。步骤。1、抽提RNA，2、反转录获得cDNA，3、以cDNA为模板做PCR。注意：1、RNA制备：一般制备总RNA即可，有时需要制备mRNA，初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol的优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizo
6、l一般可以提到全部RNA的50%以上，有些可以到达80%。mRNA最好用Qiagen的柱子，是否用DNAseI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。谈到RNA的贮存实际上主要是温度，-20是不够的，至少-80，液氮最保险。2、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，Promega、invitrgen、Roche的都不错。反转录成功后就不必太小心了，-20就可以了。3、半定量RT-PCR：这是重点，
7、此处指基于凝胶成像分析的。实验设计：根据不同的实验，对于不同的基因要有不同的策略，还有不同的组织，选择不同的基因的转录本，选择不同的看家基因，都各自不同，对于文献不可照抄。引物：对于RTPCR重要的是引物的位置，有两种方法，一种是上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3端和下一个外显子的5端，这样不会在基因组上扩出来。第二种是我最喜欢的，设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到得不一样，可以一引两用。以上原则对单外显子基因不使用，这是最好选择DNAaseI处理。另外，我们有一个好习惯，就是把退火温度设计成一样的，这样每次做的时候不用“三查七对”，从冰箱里拿出就(转载于:写论文网
8、:半定量rt-pcr试验心得)坐。另外，3最后一个碱基是很重要的。关于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。但二者不能混为一谈。基因组问题：如上所述，可以不用处理基因组的。但是如果是单外显子呢？如果样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。这是很多人碰到的问题！那就冒险让RNA高温一下吧，只是DNAase处理时一定小心，买大公司的，保险一些，至少也应该是takara的，买液体做好的，不要自己配，比起标本来，这时候银子已经退居其次了。
9、长度：500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。如果太小，防止弥散则可以用2的胶就行了。目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。如果是250，则相差100bp很好，如果400、500则差个200bp也可以。内参照：每一次一定要做内参。不作内参的结果是不可信的，实际上大部分半定量RT-PCR本身就是不太可信的，所以要反复摸，重复做，每次作内参照，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果。不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。PCR一定要同时作，但是电
10、泳可以不一起跑，没有关系，记住，计算的是相对表达程度：1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的。3、半定量RT-PCR应该在两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度一致，目的扩增区域的GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和Taq酶。解释一下：1、同一管中不是不可以，因为它有条件现同的优点，只要目的基因的扩增量和选择的不同循环数的内参照基因的最终扩增产量大致相同就很好。但是一管中的竞争抑制实在是大问题，即使对照组一
11、致了，咱做的是差异，总有不一致的，而且PCR的放大效应会把芝麻P成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配，这不用多说了吧。2、相对和准确的问题，PCR的相对定量是因为引入了内参照，所以没有绝对定量一说，至于半定量和定量的区别不是相对和绝对的区别，而是准确和不准确的区别。一般经常搞错的定量半定量和绝对量相对量的概念，定量半定量是指检测准确度，而绝对量相对量是指基因在组织中的表达丰度，例如Northen虽然不是很准，主要是上样量的原因，不管使用28s、18s定还是用SBGAPDH或者-actin都是，但是Northern得出的是绝对组织丰度，而实时荧光定量RT-PCR虽然准确但是得出的是相对表达
12、丰度，不管使用-actin还是用18srRNA。至于常规的通过跑电泳的所谓“定量”RT-PCR那就远了去了。另外，似乎有人认为要做的好，就要把条件摸得哈好的，一旦很好，就不更改，PCR条件，Taq酶，窃以为实不足取，为何？我说的“摸”是指循环数和模板，如果连taq也要固定下来，其不是别人重复不了了？因为检测的是相对量，所以理论上在PCR过程和成像过程只要在线性期，结果应该是差不多的，为什么不说一样是应为即使在线性期也是有差异的，大家看看文后的我们做的定量PCR的图就知道了，在每个点的切线的斜率是不同的。关于选择什么作为内参照的问题，实际上没有定论，有人认为，18s优于actin，实际上acti
13、n虽然相对来说很稳定的表达量，但我想在细胞分裂的过程中，需要骨架，因此actin等本身在不同细胞，不同组织、不同时期是变化的。作为骨架蛋白和细胞的分裂发育是密切相关的，在不同状态表达是不同的，不同细胞等。之所以用18s是因为相对而言核糖体RNA量相对稳定，因为它的功能是同整个基因谱有关的，更重要的它在总RNA中占地比例高，所以更准确，就像你用某一种东西的数量去概括总量，应该选那种多的，说一座房子是由XX块砖造成的，比说用29根梁更准确吧，当然你用的是mRNA就另当别论了。摸：一定要摸，关键是摸，摸上3、5摸总是必要的，首先分开一个一个摸，然后再放到一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板
14、中的量，这就是因为下面谈到的线性期和平台期的问题。线性期和平台期：根据上面摸的结果，选择线性期的起始周围的循环数作为PCR指数，这和定量PCR中的原理是一样的，这相当于取线性期曲线的切线。线性期似乎应该是指数期，只是因为2的幂和倍数正好一样？不要为了后期的亮度取线性期的晚期，那样是不准的。模板量应该越多越好，当然是指在条件允许和不影响PCR体系的情况下，也不是指把20ul都加上，还要摸呢，对吧。一般来说2ul要比1ul好，有人会问，过了一个循环不久一样了么？不一样的，这和PCR本身的原理有关，什么原理我也不懂。就像到了线性期，很多人会说，再加酶，实际上不是的，再加酶和dNTP还有引物都没用的，
15、其实这些本身就是过量的。综合上面两点，说说下面一点：一般摸出来的结果是什么呢？个人认为，再使用1ugRNA反转录后用2-4ul为模板和使用5ug反转录用12ul为模板的情况下，一般目的基因很少超过30循环，著名的-actin很少超过25循环，如果你看到有人用actin和GAPDH超过28-30循环的话，结果是不太可信的，实际上即使超过25循环也是值得商榷的，肯定在RNA或者cDNA的步骤有问题，此时因该增加模板量，而不是增加循环数，即使目的基因要用30以上也要考虑一下。对于像脾脏这样的组织，actin甚至可能要低于20循环，实际上在后文谈到的凝胶成像仪的检测范围之内，应该循环数越少越好。还是那句话，并不是在指数期就可以的。提示：另外，不是很亮并不代表没有到平台期，再看看我们的做的定量PCR的图就明白了，有些基因的平台期是达不到很高的，要看你摸的时候不同循环的扩增产物的量之间的关系，在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。一步法还是二步法：不建议采用一步法，因为逆转录酶很贵，就做一次PCR，多可惜啊！还有RNA。而且反转录了之后可以做1020次，还可以摸条件找原因。不要以为一步法是盒子，实际上是一样的
