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1、中药有效成分化学结构的研究方法,化合物纯度的判定方法1结晶均匀、一致。2固态：熔点明确、敏锐（0.51.0） 液态：沸程在5以内3TLC (PC):两种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。,一、中药有效成分的理化鉴定物理常数的测定 物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重等的测定。固体纯物质的熔点，其熔距应在0.51.0的范围内，如熔距过大，则可能存在杂质，应进一步精制或另用不同的溶剂进行重结晶，直至熔点恒定为止。液体物质可测定其沸点。液体纯物质应有恒定的沸点，除高沸点物质外，其沸程不应超过5的范围。此外，液体纯物质还应有恒定的折光率及比重
2、。比旋度也是物质的一种物理常数。中药的有效成分多为光学活性物质，故无论是已知还是未知物，在鉴定化学结构时皆应测其比旋度。分子式的确定 常用质谱法，高分辨质谱（HR-MS）3.化合物的结构骨架与官能团的确定 一般首先决定化合物的不饱和度，准确计算出结构中可能含有的双键数或环数。 用化学法推定分子结构骨架,二、四大光谱在结构测定中的应用,紫外 可见光谱（UV -VIS）,紫外 可见光谱（UV -VIS） 共轭体系特征分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n-*、-* 跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm）。,200nm 400 700nm,紫外区
3、（UV） 可见区（VIS）,应用：推断化合物的骨架类型 共轭系统取代基团的推断 如：加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、排列方式）用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）,红外光谱（IR）,分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。,4000 3600 3000 1600 1000 625cm-1,特征频率区 指纹区,特征官能团的鉴别 化合物真伪的鉴别,羟基（酚羟基、醇羟基） 36003200 cm-1 游离羟基 3600 cm-1 氢键缔合羟基 34003200 cm-1 羰基 16001800 cm-1酮 1710 cm-1酯 171017
4、35 cm-1芳环 1600、1580、1500cm-1 有23个峰 双键 16201680 cm-1,两个化合物完全相同的条件 1、 特征区完全吻合 2、 指纹区也需完全一致,红外光谱（IR）,红外光谱对结构的鉴定，主要用于功能团的确认和芳环取代类型的判断。,1H-NMR（核磁共振氢谱）,信息参数：化学位移（）、峰面积、峰裂分（s 、d、t、q、m）及偶合常数（）,（1）化学位移（C）020ppm 与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云密度）有关 电子云密度大，处于高场，值小 电子云密度小，处于低场，值大,0.9-C-CH3,1.8-C=C-CH3,2.1-COCH3,3.0-NCH3,
5、3.7-OCH3,11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0,-COOH,-CHO,Ar-H,-C=C-H,常见结构的化学位移大致范围,(ppm),推断化合物的结构（含1H核基团的结构）,（二）峰面积: 磁等同质子的数目 用积分曲线面积（高度）表示,磁不等同两个或两组1H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分,符合 n+1 规律 ( n = 干扰核数目 ),用偶合常数（J）表示,峰裂分的数目,峰裂分的距离,不同系统偶合常数 (J Hz) 大小,s 单峰 d 双峰 t 三重峰 q 四重峰 m 多重峰,1H-NMR核磁共振辅助技术,（1）重氢 (D2O) 交换 推断活
6、泼质子（羟基）的存在与否。（2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。（范例见P31）,13C-NMR（ 核磁共振碳谱 ）,信息参数：化学位移（C）碳谱的化学位移的定义及表达方式与氢谱一致，所用内标也一样，但是化学位移的幅度较宽，约200个化学位移单位，故信号之间很少重叠，识别起来比较容易。,不同 13C 核C大小与13C 核所处的化学环境（周围电子云密度）有关,用于13C 核类型的推断,( C ppm ),150220( c=o),200 150 100 50 0,c=c Ar,5080 (c-o),
7、饱和碳原子（060）,主要结构13C 核C的大致范围,化学位移：大致范围（C）0200ppm,质谱（MS）:1确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确到小数点后三位）, 计算分子式。2与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。3依据裂解特征及碎片离子，推定或复核未知化合物分子的部分结构。,电子轰击质谱（EI-MS）,但对于热敏成分及难于气化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）大分子物质（多糖、肽类）难以气化,测不到分子离子峰亦无法测得分子量,对热不稳定性的化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定,(2)化学电离质谱 CI-MS(3)场致电离
8、 FI-MS( 3 )场解析质谱 FD-MS(4)快原子轰击质谱 FAB-MS(5)电喷雾电离质谱 ESI-MS,电离新方法（样品不必加热气化而直接电离）,第1节 苷类的结构研究,苷类结构研究的一般程序： 1.物理常数的测定。Mp. 等。2.分子式的测定质谱分析法（广泛采用）电子轰击质谱（EI-MS）：不易获得分子离子峰（极性大）化学电离质谱（CI-MS）场解吸质谱（FD-MS）：常用快原子轰击质谱（FAB-MS）：常用高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）：能直接测出分子式,3.组成苷的苷元、糖的鉴定,（1）苷元的结构鉴定（见各章节）（2）糖的种类鉴定纸色谱（PC）：分配原理，BAW系统
9、，与对照品共色谱鉴定薄层色谱（TLC）：硅胶（硼酸溶液或无机盐溶液制 - 增加上样量）气相色谱（GLC）：水解、制备TMS衍生物（具挥发性），用对照品tR鉴定NMR光谱： 苷中各糖的不同质子的、J 与标准糖数据进行比较鉴定 苷中各糖的不同碳原子的 与标准糖数据进行比较鉴定,（3）糖的数目的测定,光密度扫描法测定各糖斑点含量，计算各糖分子比，推算组成苷的糖的数目质谱法测定苷及苷元的分子离子峰（分子量），计算其差值，求出糖的数目 1H-NMR谱: 端基质子的信号（大 - 处于低场）数目或者 全乙酰化或全甲基化物乙酰氧基、甲氧基信号（、J） 的数目 13C-NMR谱: 端基碳原子信号（90112pp
10、m）的数 目或者苷分子总碳信号数目减去苷元的碳信号数目,推算糖的数目,4.苷元与糖、糖与糖之间连接位置的测定,（1）苷元与糖之间连接位置的测定 13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与苷元的碳谱相比较即可鉴别醇羟基苷化，苷元-碳向低场位移（+410ppm），-碳向高场位移（-0.9-4.6ppm）酚羟基苷化，苷元 -碳向高场位移 ，-碳向低场位移,化学方法: 将苷的全甲基化物进行甲醇解，鉴定（与对照品共色谱）未全甲醚化的单糖，游离羟基所在位置即糖与糖之间的连接位置。,（2）糖与糖之间连接位置的测定,13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与相应单糖的碳谱数据相比较即可鉴别 。糖与糖相连，
11、内端糖连接糖的碳原子移向低场（47 ppm）相邻碳原子移向高场（ -1-4 ppm）,5.苷中糖与糖之间连接顺序的确定,苷,缓和酸水解酶解 乙酰解 全甲基化甲醇解,部分苷键断裂的裂解产物,分 析推 断,波谱分析法,质谱（MS）法：主要利用质谱中归属于有关糖基的碎片离子峰或各种分子离子脱糖基的碎片离子峰，可对糖的连接顺序作出判断。EI-MS ： (需作成全甲基化、乙酰化或三甲基硅醚化物) 常见各单糖及双糖的全乙酰化物、TMS衍生物 碎片离子峰见书。FD-MS 或FAB-MS：常出现各种脱去不同程度糖基的 碎片离子峰。,6.苷键构型的确定,（1）利用酶水解法(酶的专属性)（2）利用开勒（Klyne
12、）经验公式进行计算MD = M D苷-M D苷元,与各糖的一对甲苷（ -、-）的分子比旋度相比较， 与 -甲苷接近，则该苷键构型为 -构型 与-甲苷接近，则该苷键构型为-构型,1H-NMR利用端基质子偶合常数的大小判断苷键构型,依据,相邻碳原子上质子偶合常数的大小与二者之间的立体夹角有关,H-2为键的糖（葡萄糖、木糖、半乳糖）,H-2为e键的糖 （鼠李糖、甘露糖）,-苷键 -苷键 -苷键 -苷键J12 = 23.5Hz J12= 69Hz J12= 2 Hz J122 Hz(Jae、60O) （Jaa、180） （Jee、60） （Jae、60O）,J12不相等 J12相等,意义,可以用于构型的判断 不能用于构型的判断,（3）利用核磁共振（NMR）确定苷键构型,-D-葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷 J12 = Jae = 23 Hz J12 = Jae = 2 Hz,-D-葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷 J12 = Jaa = 69 Hz J12 = Jae = 2 Hz,如表3-4，利用端基碳原子的化学位移判断苷键构型，除D-甘露糖、L-鼠李糖外，绝大多数单糖甲苷，其 -型与-型的化学位移相差4ppm。 如表3-5 利用端基碳原子与端基质子的偶合常数判断苷键构型 -甲苷 JC1-H1170Hz -甲苷 JC1-H1160Hz 10ppm,
