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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划免疫学溶血实验报告溶血性实验实验目的：通过本实验认识溶血现象，并掌握溶血性实验常规的体外试管法的基本操作实验原理：溶血是指红细胞破裂、溶解的一种现象。药物制剂引起的溶血反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为II型和III型变态反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起的血液稳定性改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血实验室观察受试物是否会引起溶血和红细胞聚集等反应。有些药物由于含有溶血性成分或物理、化学、生物等方面
2、的原因，在直接注射入血管后可产生溶血现象；有些药物注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能的障碍等。有些中草药含有皂苷等成分，具有溶血作用。凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血的药物制剂，均应进行溶血性实验。实验方法1.2%红细胞悬液的制备取新鲜鼠血1020ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加入生理盐水100ml，摇匀，10001500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤23次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2%的混悬液(红细胞2ml，加生理盐水至100ml)，供试
3、验用。2.取10ml干净玻璃试管7支，编号，1至5号管为供试品，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管(完全溶血对照)。按表1所示，依次加入2%红细胞悬液。0。9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置(370。5)的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。表1溶血实验设计表表2溶血试验结果判断标准全溶血溶液澄明，红色，管底无红细胞残留部分溶血溶液澄明，红色或棕色，底部有少量红细胞残留;镜检红细胞稀少或变形不溶血红细胞全部下沉，上清液体无色澄明;镜检红细胞不凝聚红细胞凝聚溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散当阴性
4、对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用，若受试物中的溶液在3小时内发生溶血或聚集，则受试物不能注射使用。注：表示无溶血，+表示部分溶血，+表示全溶血注意事项：溶血反应发生机制复杂，目前尚无标准的临床前体内实验方法全面评价药物制剂的溶血反应，因此在长期毒性研究中应该兼顾考虑制剂的溶血性，注意观察溶血反应的有关指标和体征，如出现溶血是，应进一步研究。免疫学基础及实验技术实验报告姓名:姚丽君专业：针灸推拿学年级：XX年研究生实验室：免疫试验室时间：XX年1月12日教师：李永念老师免疫学教研室人血清I的提取及鉴定一主要原理：离
5、子交换层析提取人血清IgG：离子交换剂采用DEAE-纤维素，是表面交联有二乙基乙胺基团的纤维素，本身带有真电荷，能吸附阴离子。DEAE-纤维素悬浮在PH高于，克分子浓度低的缓冲液内，置备成层析柱。人血清经过磷酸缓冲液透析平衡后，其中的IgG不带电荷或仅带少量电荷，其他的蛋白质则主要带负电荷，这样的血清样品通过相同缓冲液平衡好的DEAE-纤维素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，仅IgG最易形成吸附-解离-再吸附-再解离的状态，因此能随洗脱液一起最早从柱中流出，收集洗脱液获得IgG。血清I鉴定：以收集的洗脱液为抗原，与兔抗人IgG做琼脂双扩散实验，可根据沉淀线的形成确定IgG抗原性。用免疫电
6、泳法使血清中各种蛋白的分子大小以及电荷状态、电荷量均有差异，因而它们的泳动速率也不相同，根据在凹槽中加入免抗人血清，上下两孔加入用蔗糖包埋法进行浓缩后的浓缩液和正常人血清，经一段时间后出现沉淀弧，根据沉淀弧的情况来检测所获的IgG的纯度。用754型分光光度计于280nm紫外光源测定洗脱液光密度值，根据IgG的E1cm1%=(OD)公式，可计算出收获的IgG含量，并推算出所获得IgG的百分率。二主要材料：1NaOH、HCL、%NaCL按常规配制2DEAE-纤维素健康人全血3磷酸缓冲液420%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制5蔗糖6巴比妥纳-巴比妥缓冲液，2MNaCL水溶液7%琼脂凝胶8布氏漏斗、抽
7、滤瓶、水泵、试管，烧杯，玻璃棒，滤纸试纸、蝴蝶铁架、透析袋、离心机，746-电泳仪、754型分光光度计三、操作步骤：DEAE-纤维素预处理：1、称取DEAE-纤维素1克，均匀撒在事先盛有150ml的烧杯中，人其自由沉降，放置分钟，不时地用玻璃棒轻轻搅动。2、将湖状物移入垫有滤纸的布氏漏斗中，连接漏斗抽滤瓶，并用水泵抽干糊状物。立即将DEAE-纤维素移入烧杯中，加蒸馏水，浸泡20-30min并不时搅拌，再移入漏斗抽干，如此重复，至洗出的PH值等于8即可。3、将交换剂移入150mlHCL中放置40-50min，不时轻轻搅动，移入布氏漏斗抽滤，再依同法用NaOH处理一次，时间不超过50min。4、重
8、第2项操作，至抽滤液PH值等于8即可，最后液浸泡交换剂，抽干，再重复一次，然后将交换剂用相同PB调成糊状，保留至装柱。装柱、平衡1、固定层析柱在蝴蝶铁架上，垂直。柱上方放置液的洗脱瓶，以乳胶管相连，柱底部有细胶管，装止水夹，调节流速。2、将上糊状物倾入柱中，打开柱底流出口，用烧杯接流出液，注意不能断层，纤维素中不允许进空气，柱上表面要平，上部要留有约3cm高空间。上样和洗脱1、将人血置离心机以XXrpm，10min离心，取出并用毛细吸管吸取10ml人血清装入透析袋，于烧杯内浸入40倍于血清体积的起始缓冲液中，置4冰箱内透析过夜，中途更换两次缓冲液;2、打开柱上端塞子，用带有橡皮乳头的毛细吸管吸
9、出交换剂表面的缓冲液，至仍2mm厚的液面，以免空气进入;3、用清洁细吸管将已平衡好的血清样本原柱管内壁缓缓加在纤维素柱表面，调节流速，使样品进入交换柱内，约3ml/10min;4、待液面还约2mm厚的样品时，用少量起始PB冲洗柱内壁，到PB进入交换剂仍留有2mm后液面时，再冲洗二次，保持柱面平整;5、最后加适量起始缓冲液，连接洗脱瓶，流速调至30-40ml/cm2/h;6、收集洗脱液与试管中，每管5ml，共收集12管。并从各管中取1-2滴，加20%三氯醋酸1-2滴检测。洗脱液抗原性鉴定1、用%琼脂凝胶制版，根据下图用打孔器打孔：2、加样：中心孔加入兔抗人IgG，从收集的12管洗脱液中用毛细吸管
10、吸取洗脱液分别加入周围六孔，每孔所加样品的量以液面与孔测平齐为准；3、将琼脂板置湿盒内37温箱孵育24小时，观察结果。IgG纯度鉴定1、琼脂板制作：用1.5%琼脂凝胶加热融化后倾注在载玻片上，玻片上放一条细玻棒，等凝胶凝固后在玻棒上下两侧打孔，制成如图所示：2、型分光光度计测各管洗脱液在波长280nm的光密度值，第一个蛋白峰为IgG，收集有IgG活性的三管洗脱液，混合后装于透析袋内，用蔗糖粉末将其包埋使其浓缩；3、加样：如图示上孔加入浓缩的IgG提取液，下孔加入正常人血清，将加样后的琼脂板置于746-电泳仪上，用四层纱布条做桥，连接凝胶板与电极缓冲液。该桥搭在凝胶上部分约5mm，尽量拉直，与胶
11、面间不能有气泡；4、连接电源，调节指示电压至100V，电泳槽加盖后，电泳至血清蛋白迁移至距正极段边缘1cm处，关闭电源；5、凝胶板与桌面，取出玻条，凝胶中部既成一长槽，加兔抗人全血清加入槽内与胶面水平；6、置凝胶板与湿盒内，于37或室温中孵育，12小时观察沉淀弧出现的情况。7、计算回收率：取透析袋内浓缩的提取液，用754型分光光度计测波长280的光密度值，如果超出测定范围，稀释后再测，按浓缩后IgG(mg/ml)=OD280回收体积，正常人血清IgG:12(mg/ml)收集的血清体积，回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG，计算回收率。四、实验结果：1、DEAE-纤维素洗脱，收集洗脱液12管，均
12、为略带黄色的液体，取样添加20%三氯醋酸，各管中仅第4、5管出现浑浊，表明试管洗脱液中含蛋白质。其余管未见明显反应。2、745型分光光度计测出12管洗脱液的光密度值如下：做A280光密度值峰值曲线图如下：A280a)经过蔗糖粉末包埋后，收集到浓缩的IgG为，测其OD值为，此值已经超出光密度计测定范围，取0。5ml浓缩液加生理盐水稀释5倍后测OD值为。b)按下列方法计算IgG回收率：浓缩后IgG：C(mg/ml)=OD280体积正常人血清IgG：12(mg/ml)体积(转载于:写论文网:免疫学溶血实验报告)(8ml)回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG=5/128=%3、向琼脂扩散试验结果如下图
13、，有白色成沉淀线出现，彼此相互融合相连。4、疫电泳如下图，有沉淀弧出现，提取液与抗人全血清之间只出现一条沉淀弧，并靠近凝胶板负极端，说明所提取IgG为纯品。人血清与抗人血清之间由于存在多抗原抗体成分，所以出现多条沉淀弧。五、分析与讨论：IgG是一种具有抗体活性的免疫球蛋白，其具有一般蛋白质的通性，是再次体液免疫应答产生的主要Ig。IgG主要由脾脏和淋巴结中浆细胞合成，含量高，分布广，它能与抗原特异性结合，从而在体内介导多种生理和病理效应。本次试验是利用离子交换剂的特性，血清中IgG不带电荷或仅带少量电荷，其它的蛋白质则主要带负电荷，使人血清通过带阳离子DEAE-纤维素制成的交换剂，带负电荷的蛋
14、白质与阳离子交换剂结合，而不带电荷的IgG处于游离状态，用的磷酸缓冲液通过层析柱，未结合的IgG随洗脱液一起流出，试管收集，这样使血清样品通过DEAE-纤维柱而得以分离出IgG。收集的洗脱液颜色略带黄色，可能是收集血清时吸入了破碎的红细胞。在加入三氯醋酸后4、5管出现沉淀，说明从第4管开始有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3、4、5三管，并峰值上升和下降很快，未见馒头峰，证明洗脱较好。本次试验已成功地收集了IgG。从双向琼脂扩散试验的结果看，中间孔抗人IgG与周围孔的提取液IgG之间的凝胶出现一条白色沉淀线，3、4、5孔之间形成的沉淀线相互吻合，这说明IgG与抗体抗人IgG浓度相当，提取液为单一抗原，即IgG。通过免疫电泳结果看：在滴加浓缩提取液的一测出现一条沉淀弧，说明浓缩提取液中只有一种抗原物质，而在滴加正常人血清的一测出现多条沉淀弧，说明正常人血清中存在多种抗原物质。所以，通过以上两个试验证明：经分离提取的为纯IgG。根据回收率看本实验的提取及回收比较有效，亦可根据公式计算IgG的浓度为/ml。键入公司名称免疫学实验教案研究生教育实习潘熙萍(YXX0201)XX/1/14在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。实验一免疫血清的制备一、实验目的熟悉免疫血清的制备过程；了解动物实验的基本知
