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1、DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),一、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时
2、，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G
3、 C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但
4、不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、复制的半不连续性,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向
5、与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他
6、的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,目 录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,（一）原核生物的
7、DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，
8、有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,（二）真核生物的DNA聚合酶,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-
9、pol不表现活性。,（二）复制的保真性和碱基选择, DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E. Coli 基因图,解螺旋酶(helicase) 利用
10、ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断
11、端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目 录,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,
12、需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,目 录,领
13、头链的合成,目 录,随从链的合成,目 录,目 录,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,目 录,复 制 过 程 动 画,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,目 录,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。
14、复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,
15、5,5,目 录,目 录,切除引物的两种机制,目 录,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与m
