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1、月亮县中医院项 目文件编号：YCXZYYJYK_SOP_14页码：第- 116 -页，共116页检验科临床微生物SOP手册版本：第3版，第1次修订生效日期：20180101临床微生物SOP手册目录编 号名 称页 面SOP_14-1微生物学检验标准操作程序3-57SOP_14-2附件1 临床微生物学标本采取和处理的规范化要求58-62SOP_14-3附件2 临床微生物学血培养操作规范63-66SOP_14-4附件3 生物KB的XXXX实验室检测67-73SOP_14-5附件4 抗菌药物临床应用指导原则74-102SOP_14-6附件5 微生物药敏专家分析规则103-114文件审批者：发布日期：操
2、作者从事本项工作前，必须认真学习并掌握本手册的内容，严格按照操作规程操作！学习者:休订书册与增补程序内容与日期：学习者：休订书册与增补程序内容与日期：学习者：SOP_14-1 临床微生物学检验标准操作程序一、 目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。二、 适用范围：微生物鉴定及药物敏感试验。三、 操作人员：检验科授权工作人员。四、 操作步骤：1 试剂与材料：1.1 孵育温箱：可调温度范围应由室温至60，温箱内要保持一定的湿度。温箱在使用时，箱内必须放置1只温度计，或设有另外的温度指示仪表，指示每时每刻的温度。每天早晨第一次开启温箱门后，首先观察温度，随手将温度
3、记录在质控图表中，一旦发现温度升高或降低，应及时调整。温箱温度正常的波动幅度应为所定温度士1。1.2 显微镜：一般的光学显微镜就可满足常规要求。自制暗视野（纸片）和萤光光源连接显微镜组成荧光显微镜。1.3 CO2培养设备：蜡烛罐（以真空干燥罐、放入点燃的蜡烛，将罐盖盖上并密闭）。1.4 厌氧培养设备：厌氧袋。1.5 高压灭菌设备：手提式蒸气消毒锅。1.6 冰箱：每天早晨第一次开启温箱门后，首先观察温度，随手将温度记录在质控图表中，一旦发现温度升高或降低，应及时调整。温度正常的波动幅度应为所定温度士1。1.7 pH计：系列酸度计。1.8 离心机：离心物必须密闭，严防污染。1.9 火焰灯：酒精灯。
4、1.10 天平：万分之一分析天平和物理天平。1.11 接种器具：制备好的镍铬丝接种环。紧急时可用300W的电炉丝自制。1.12 平皿：塑料的无菌平皿。1.13 染色液：革兰氏、抗酸、鞭毛、墨汁、异染颗粒染色液，为XXXXGS产品。1.14 培养基：血培养、巧克力、中国兰、麦康凯、SS、克氏铁、碱性、庆大、4号、营养、沙保罗、TTC、血液增菌瓶等使用XXXXGS产品。1.15 葡萄球菌、肠杆菌科、弧菌科、非发酵菌生化编码鉴定管，为XXXXGS产品。1.15 诊断血清：痢疾、伤寒、霍乱诊断血清，为XXXXXXGS产品。2 临床细菌学检验标本的处理：2.1 临床标本细菌的分离：分离细菌的目的是为疾病
5、的病原学做诊断，也即查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性。这对于临床诊断、治疗、预后和流行病学的调查是很有价值的。在分离时应掌握以下原则：(1) 人体的很多部位与外界相通，存在正常菌群，但不致病，分离时应区别标本中是属于常居菌群的污染或是致病菌。如痰标本，由于咳出时必经口咽部，而口咽部又会存在大量的正常菌群，所以标本必然混杂有常居菌群，了解口咽部存在的常栖菌群，对于区分致病菌是必要的。另外，机体的某些部位是无菌的，如检到细菌，应视为致病菌，如血液、脑脊液、骨髓等。必须排除采样及操作中的污染，特别是条件致病菌，如果有可能应重复取样。(2) 了解标本来源及临床情况，这样能有目的地检出BYJ
6、，因此要求送往细菌室的标本必须同时有一完整清楚的申请单，包括标本来源、是否用过抗生素和采样时间，否则，应向临床询问或退回标本。(3) 根据标本来源和可能存在的BYJ，确定选用各种分离培养基及孵育环境。如痰标本一般选用血平板、中国蓝麦康凯、巧克力平板作分离。血平板用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌的分离等；中国蓝麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌；而含300gm1杆菌肽的巧克力平板用于筛选嗜血杆菌等，以期提高细菌检验的准确性。如临床医师有特殊要求，需选用特殊培养基做细菌分离时，也可选用不同的培养基来替换，或增加新的培养基。临床标本常规分离用培养基：临床标本染色培养基b增菌培养基附加培
7、养基及备注血液EB(C02，ANO2)骨髓BA，ABA，CAcEB尸解(血液、组织)据具体标本处理脓肿/液(闭锁性创伤)GBA，CA，ABA，EAEB(C02，ANO2)盐水乳化颗粒体液(除血液、CSF、尿外)稠厚脓性外，体液标本离心沉淀 2 500rmin，15min，取沉淀物胆汁GBA，ABA，CAEB涂片提示关节液EAEB心包、腹/胸膜液GBA，CA，ABAEB中心静脉压力管，脐的，静脉内导管EAEB用无菌镊子将管前后交叉滚动4次于血平皿再浸泡于增菌培养基。中枢神经系统脑组织G同脓肿处理离心沉淀 2 500r/min，15min，流感嗜血杆菌需离心力 1 000g,10min脑脊髓液，分
8、流液GBA，CA，ABAEB耳：内耳GBA，CA，EAEB涂片提示外耳GBA，CA，EA涂片提示眼：结合膜角膜选用真菌专用培养基眼内的涂片提示女性生殖道：羊膜液体GBA，CA，ABAEB涂片提示子宫颈GBA，SNA，EA涂片提示陷凹GBA，EA，SNA，ABAEB涂片提示尿道G/OSNA涂片提示子宫(内膜胚胎、胎儿、胎盘恶露、输卵管、卵巢)GBA，SNA，EA，ABAEB涂片提示阴道GBA，EA，SNA涂片提示，真菌专用培养基外阴(前庭腺脓肿)GBA，EA，SNAEB涂片提示男性生殖道：前列腺液GBA，EA，SNA涂片提示睾丸、附睾、抽出液GBA，CA，EA，SNAEB涂片提示尿道GSNA，B
9、A，CA肠道：结肠、回肠、粪、肛拭子等EA，ESAM，ESAH，CSA弧菌、耶尔森菌需要专用培养基，怀疑淋病奈瑟菌选用SNA，伪膜性肠炎标本,据涂片检查选择专用培养基上呼吸道：鼻BA鼻咽BA，CA咽喉、喉BA，CA鼻窦GBA，EA，CA，ABA涂片提示口腔G酵母菌培养穿刺液参考体液标本下呼吸道：痰GBA，EA，CA涂片提示气管抽出液或刷子GBA，EA，CA支气管抽出液GBA，EA，CA提示军团菌选专用的培养基及免疫学检测支气管肺灌洗吸出液GBA，EA，CA，ABAEB涂片提示肺穿刺或活组织GBA，EA，CA，ABAEB涂片及临床提示皮肤：深部创伤(开放性)GBA，CA，EA，ABAEB涂片提示
10、浅表创伤GBA，EA涂片提示外伤(烧伤,叮咬,褥疮,溃疡)GBA，EA，ABA涂片提示组织(外科或活检)GBA，EA，ABA涂片提示，无菌浸软尿：洁尿或导尿G/OBA，EAO.001m1平皿计算耻骨上弓膀胱穿刺，膀胱镜GBA，EA，ABAO.1m1平皿计算注：aCO2，孵育于5%1O%COz环境下；AN02，孵育于厌氧环境下；G，革兰染色；O，任意选择；BA，血液琼脂平板；CA，巧克力琼脂孵育在C02环境下；ABA，厌氧琼脂加有血红素和维生素K2；EA，肠道用琼脂(包括麦康凯琼脂，伊红美蓝琼脂等)ESAM，肠道用中等选择培养基(如HE、SS琼脂等)；ESAH，肠道用强选择性培养基(如硫酸铋琼脂
11、，煌绿琼脂)；CSA，弯曲菌选择培养基；SNA，奈瑟菌选择性培养基；EB，增菌肉汤(心 脑浸出液、胰大豆酪蛋白胨液、牛肉浸出液等)。b实验室根据临床诊断和标本来源，选择培养基。c常规性处理孵育在CO2环境中，亦可根据标本来源而定。2.2 血液及骨髓标本的处理：血液培养是用于检测菌血症、真菌血症患者血液中的微生物。健康人体的血液是无菌的。当人体局部感染向全身播散和出现全身感染时，血液中可出现细菌，依程度不同称为菌血症或败血症。大多数的菌血症是间歇性的，往往需要以多次血培养阳性证实。表皮葡萄球菌，既可是致病菌，也是较常见的污染菌。血培养只有在给患者用抗菌药物前抽血，才可能得到较高的阳性率。厌氧菌菌
12、血症者约占菌血症的 5%15%，6%15% 是复数菌菌血症。细胞壁缺陷型细菌(L 型菌)菌血症可见于大量使用抗生素的患者，免疫缺损的患者易发生念珠菌真菌血症。血液/骨髓培养常见BYJ革兰阳性菌革兰阴性菌金黄色葡萄球菌脑膜炎奈瑟菌表皮葡萄球菌卡他布兰汉菌A 群、B 群链球菌伤寒及副伤寒沙门菌草绿色链球菌大肠埃希菌肺炎链球菌肺炎克雷伯菌肠球菌肠杆菌属菌种厌氧链球菌沙雷菌产单核李斯特菌铜绿假单胞菌产气荚膜梭菌假单胞菌属菌种丙酸杆菌不动杆菌念珠菌流感嗜血杆菌胎儿弯曲菌拟杆菌梭杆菌2.2.1 标本的接种：(1) 培养基： 血培养基中都必需添加SPS(Sodium Polyanethol Sulfonat
13、e，聚茴香脑磺酸钠)，其浓度应为O.25O.5gL。SPS既是一种抗凝剂，它又可抑制血清中杀菌物质，抑制吞噬细胞，不活化补体，中和溶菌酶及氨基糖甙类抗生素对细菌的作用。但SPS本身有可能抑制个别细菌的生长繁殖，如奈瑟菌。 培养基种类很多，不论哪一种都要有需氧培养及厌氧培养两类。1 液体培养基有脑心浸液、布氏菌用培养基、胰大豆酪蛋白胨等。2 双相培养基，即在培养瓶内有琼脂层与肉汤垂直。3 氨基苯甲酸溶液使用浓度：配制O.5%溶液，取10ml加到1000ml培养基中。4 硫酸镁浓度：24.7%硫酸镁(单独灭菌)20ml加到1000ml培养基中。(2) 取血量：采血量一般以肉汤培养基的110为宜。 急性败血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎、急性未处理的细菌性肺炎和肾盂肾炎，应在治疗前从不同部位采集
