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1、靶向PCR CTC检测技术 帮助临床医生更全面地评估肺癌,Lung Cancer in Solid Tumor in China,=,？,液态活检 通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤,病理活检 通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤,CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others,传统的组织细胞学检测,液态活检在肺癌中的应用,治疗策略,事件,疑似肺癌,辅助诊断,早癌肺癌,晚期肺癌,癌症耐药,复发监测,治疗方案选择,耐药机理 新药研发,CTC的临床应用价值,疗效评估,CTC(数量） (负向富集+靶向PCR）,ctDNA (基因变异）,1、K. Pantel, et al
2、. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态,CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征
3、的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2,什么时候可以检测到CTC？,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象,CTC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集
4、 or 阳性富集) 微流体,CTC 检测方法,CTC检测技术 靶向PCR 免疫荧光 普通PCR,=,+,“方法”,“收获”,“垃圾”,蟹饵,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没贪嘴， 我们逃了,“方法”,“收获”,“垃圾”,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没吃胖， 我们逃了,网 筛,CytoploRare （FR靶向PCR CTC检测技术） 检测原理,负向富集,靶向PCR,FR阳性靶标,肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达 CTC：FR=1:50万 EMT转化不影响FR丰度 其他血细胞不表达FR,
5、CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自动化,灵敏度超高，负向富集可满足检测要求 信号二次放大，1个CTC信号放大1012倍 无需人工经验判读，结果客观准确 可实现CTC的定量,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性,1个CTC信号放大1012倍,优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞,优势二：靶向探针特异性高,优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性,优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,3mL血,1mL/3
6、mL血,3mL血,1个CTC/3mL血,50万FR/1个CTC,1个CTC/1slide,100万信号/1个FR,1个信号/1个CTC,FR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法1012倍（万亿倍）,细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 1,200,000白细胞,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=
7、1/240万600万,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 6,000,000白细胞,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 FR（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）,特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性,背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果
8、一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定,22,EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）,EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC,Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,2004,Cell Search:
9、 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程,有报道，部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1 临床前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变3,1、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测
10、技术 巨噬细胞（可能存在FR表达）不影响检测结果,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 同一患者重复检测，可重复性高,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,3mL血6个小时得到报告,检测流程,肺癌领域，CTC检测技术对比,唯一获得CFDA批准的肺癌CTC检测试剂盒,CTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,CTCs：可反应肿瘤发生
11、发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,1210例受试者,肺癌 560例,肺部良性疾病 350例,其他肿瘤 (150例) 肝癌 30例 结直肠癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例,331例A 100例B 50例C（21例D) 79例D,A: 基线CTC检测 B：术前术后CTC监测 C：一线含铂双药化疗中CTC监测 D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测,300例A 50例D,健康人 150例,100例A 50例D,15
12、0例A,非动态研究 肺癌 560例A 肺部良性疾病 350例A 健康人 150例A,动态监测研究 非小细胞肺癌 100例B 50例C,对比研究 肺癌 100例D 肺部良性疾病 50例D 健康人 50例D,肿瘤特异性研究 其他肿瘤 150例A,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 临床试验设计（1210例, 最大样本量）,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,36,患者特征,Jiatao Lou, et al. Plos O
13、ne 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 叶酸受体阳性CTC作为诊断标志物,38,最大样本量CTC检测数据 Cutoff： 8.70 CTC Units/3mL 敏感性：79.6% 特异性：88.2%,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,
14、AUC: 0.8797,CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 所有肺癌，敏感性提高3倍；I期肺癌提高10倍,CTC对肺癌的诊断显著优于一般肿瘤标志物,CTC与一般肿瘤标志物对肺癌诊断的准确性（AUC值）,单项CTC检测的辅助诊断价值优于多个一般肿瘤标志物联合,AUC=0.91, P0.0001,AUC=0.76,不同病理类型中，CTC辅助诊断价值均优于一般肿瘤标志物,CTC对期肺癌的阳性检出率高达67.2% 其他最优的肿瘤标志物的敏感度仅为32.3%,1cm肺癌总体敏感性: 62.5%,CTC联合CT可以大大提高小结节诊断的特异性 CTC辅助CT可以将小结节的判别假阳性率降低到
15、10%,Lou JT, Wang L, et al In submission,上海市胸科医院：病例一,VATS右肺上叶切除术：右肺上叶细支气管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0， 直径0.8cm,VATS右肺上、中叶切除+系统性淋巴结清扫： 术后病理确诊：右上叶腺癌（非粘液性）、细支气管肺泡癌及肺泡样混合亚型，高分化， T1aN0M0 肿瘤大小：0.5*0.7*0.4cm,上海市胸科医院：病例二,CTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态,Cancer Control, 2015,肺癌辅助诊断 降低胸部CT假阳性率，减少肺癌漏诊 肺癌化疗疗效评估 评估肿瘤功能活性状态，弥补RECIST标准不足,CTC：用于化疗疗效评估，先于肿瘤大小发生变化，评估肿瘤功能状态,NSCLC, 1st-line carboplatin, paclitaxel (d); NSCLC, 2nd-line pemetrexed(e) Baseline CT scans were before therapy initiation and CTC measurements began at or shortly after the first treatment.,CTC数量变化与RECIST标准基本一致,相同SD患者，CTC下降患者PFS可能更长,1210例受试者,肺癌
