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1、溶血性贫血 G6PD试验、血红蛋白电泳、 Coombs试验、红细胞渗透脆性试验 .,什么叫溶血性贫血？ 各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。,病 因 （一）红细胞内存在缺陷 1.遗传性： （1）膜的缺陷：遗传性球形细胞增多症 （2）酶的缺乏：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏 （3）珠蛋白生成障碍：即血红蛋白病 肽链合成量的异常：地中海贫血 肽链质的异常：异常血红蛋白病 2.获得性：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）,（二）红细胞外在因素 1.免疫性因素： （1）自身免疫性溶血性贫血（AIHA） （2）同种免疫性溶血性贫血： 新生儿溶血
2、症；血型不合的输血反应 2.物理和机械损伤： （1）行军性血红蛋白尿症、人工心脏瓣膜 （2）物理损伤：大面积烧伤、放射损害 3.化学药物和生物因素： （1）磺胺类、苯类、砷和铅等 （2）疟疾、溶血性链球菌、支原体肺炎、蛇毒和毒蕈中毒,临床表现 （1）急性溶血性贫血： 头痛、呕吐、高热 腰背四肢酸痛，腹痛 酱油色小便 面色苍白与黄疸 严重者有周围循环衰竭、少尿、无尿 （2）慢性： 贫血； 黄疸； 肝脾肿大,如何诊断溶血性贫血？ 第一步 确定是否有溶血 第二步 哪一类溶贫 一、首先确定有溶血,1、找出RBC破坏增多的依据 （1）RBC寿命测定15天（正常半衰期 2532天） （2）血片见RBC碎片
3、 （3）血浆游离HB增高（血管内溶血） （4）HB尿检测（），酱油色 （5）尿含铁血黄素试验（） （6）血清非结合胆红素（间接胆红素） 增高 （7）尿胆原增高,（8）血清结合珠蛋白检测 均减低 2、 找出RBC代偿增生的依据 （1） 网织RBC增多,网织RBC,有核红细胞,（2） 外周血见有核RBC （3） 骨髓红系统增生明显活跃 （4）红细胞形态异常：多染性、Howell-Jolly小体、cabot环、红细胞碎片,Howell-Jolly小体,cabot环,红细胞碎片,镰状红细胞,球形红细胞,脾脏，窦状隙被球形 红细胞塞满了,靶性红细胞,二、哪一类溶血性贫血？,常用筛查病因诊断试验 （1）红
4、细胞渗透脆性：增加：球形细胞 减低：地中海贫血 （2）Ham试验阳性（PNH） （3）高铁血红蛋白还原试验和G-6-PD酶活性试验：G6PD缺乏症 （4）血红蛋白电泳和碱变性试验：地中海贫血 （5）异丙醇试验：不稳定血红蛋白病 （6）Coombs试验（AIHA）,一、红细胞膜缺陷的检验,一、红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,酸溶血试验 (Ham),1、 红细胞渗透脆性试验 原理:是测定红细胞对不同浓度 低滲氯化钠溶血的抵抗能 力 渗透脆性减低 渗透脆性增高,方法：,0.6,0.4,0.2,NaCl,参考值 开始溶血：0.42%0.46%（4.24.6g/L）NaCL 完全溶血：0.28%
5、0.34%（2.83.4g/L）NaCL,临床意义 （1）脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 （2）脆性减低 小细胞低色素性贫血：海洋性贫 血、缺铁性贫血,红细胞孵育渗透脆性试验 原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高 。 参考值 未孵育 50%溶血44.45% 孵育 50%溶血4.655.9% 意义 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 脆性减低 缺铁性贫血 珠蛋白生成障碍性贫血,一、红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,酸溶血试验 (Ham),2、酸溶血试验 (Ham) 原理：红细胞+弱酸血清（pH6.66.8） 37 1小时 红细胞膜对补体
6、敏感， 备解素作用下溶血。,临床意义：正常人阴性， 阵发性睡眠性 血红蛋白尿阳 性（PNH）,PNH不同时间尿样,含铁血黄素,Ham试验,二、红细胞内酶缺陷的检验,二、红细胞内酶缺陷的检验,自身溶血试验及纠正试验,高铁血红蛋白还原试验,1、自身溶血试验及纠正试验 原理：细胞内酶缺陷（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6PD）(丙酮酸激酶)，葡萄糖效解障碍，不能提供足量ATP，红细胞在自身血浆中温育48小时，不能继续从血浆摄取葡萄糖作能量来源，ATP减少，不能维持红细胞内钠泵作用，导致溶血增加。在温育过程中分别加入葡萄糖和ATP作纠正物，看溶血能否纠正。,参考值： 正常人轻微溶血，溶血度3.5%； 加
7、葡萄糖、ATP溶血明显纠正， 溶血度1%。 临床意义： （ 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6PD缺乏症 蚕豆病）溶血增加，加葡萄糖、ATP溶血部分纠正，（丙酮酸激酶缺乏症）加葡萄糖不能纠正。加入ATP能纠正。,二、红细胞内酶缺陷的检验,自身溶血试验及纠正试验,高铁血红蛋白还原试验,2、高铁血红蛋白还原试验 原理：正常血红蛋白是亚铁血红蛋白，可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶可作为血液中高铁血红蛋白还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷
8、酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为褐色，在630650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。,参考值：定性：阴性。 定量：还原率75%。 临床意义： （1）阳性：葡萄糖-6-磷酸脱氢-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症、纯合子型、中间反应为杂合子型。 （2）定量30%：G-6-PD缺乏症纯合子型。 （3）定量74%31%：G-6-PD缺乏症杂合子型,注意事项：,（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。 （2）抗凝剂以38g/L柠檬酸钠或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标本可保存1周左右。肝素抗
9、凝也可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本只能保存3天。草酸盐抗凝不适于本法。 （3）ACD抗凝剂量不宜太多，血液与ACD抗凝剂按10.15混合即可，否则可因pH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。,二、红细胞内酶缺陷的检验,G-6-PD荧光斑点法试验,G-6-PD活性测定,1、G-6-PD荧光斑点试验 原理：在葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和NADP存在下葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光 参考值：正常人会出现强荧光。G6PD缺乏者的荧光很弱；杂合子或某些G6PD变异体则可能有轻度到中度荧光 注意事项： 1、此
10、法是直接测定NADPH的量，特异性较好 2、每次检测均要做阴阳性对照,二、红细胞内酶缺陷的检验,G-6-PD荧光斑点法试验,G-6-PD活性测定,2.1、G-6-PD活性校正值测定 原理： G-6-P+NADP+ G6PG 6-PGA+NADPH+H+ 6-PGA+NADP+ 6-PGD R-5-P + NADPH +H+CO2，在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。 参考值：,临床意义： 1、G-6-PD、G-6-PD/6-P-GD均偏低 见于G-6-PD缺乏症 2、G-6-PD偏低、而6-P-GD升高 见于G-6-PD重度缺乏 合并地中海贫血症 3、 G-6-PD与6-P
11、-GD均升高 多见于单纯性地中海贫血 4、 G-6-PD正常， 6-P-GD均升高 多见于G-6-PD杂合子合并地贫或其他增生性贫血患者,2.2、G6PD活性简易法测定 原理： G-6-P+NADP+ G6PG 6-PGA+NADPH+H+ 在340nm处监测NADPH吸光度的升高，计算酶的活性。 参考值： 健康成年人，红细胞G6PD活性为8-18U/g Hb,临床意义： 红细胞G-6-PD催化反应生成的NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，还原性谷胱甘肽（GSH）是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件。红细胞G6PD缺乏者，在服用某些药物（如抗疟药、砜类药、伯氨喹啉、磺胺药等）及食用蚕豆
12、后，代谢产生自由基，或者氧合血红蛋白作用形成的H2O2，使GSH氧化成GSSG，由于GSH降低，Hb的疏基失去GSH保护，被氧化变性形成Heinz小体。红细胞膜失去疏基保护而功能受损，导致溶血，G6PD基因在X染色体上，通过女性遗传，男性患者居多。G-6-PD缺乏或者减少见于G6PD缺乏症、药物反应、蚕豆病、感染等。,治疗措施： 对急性溶血者，应祛除诱因。在溶血期应供给足够水分，注意纠正电解质失衡，口服碳酸氢钠，使尿液保持碱性，以防止血红蛋白在肾小管内沉积。贫血较轻者不需要输血，祛除诱因后溶血大多于1周内自行停止。贫血较重时，可输给G-6-PD正常的红细胞1-2次。应密切注意肾功能，如出现肾功
13、能衰竭，应及时采取有效措施。新生儿黄疸可用蓝光治疗，个别严重者应考虑换血疗法，以防止胆红素脑病的发生。抗氧化剂还原型谷胱甘肽可稳定红细胞膜，从而减轻溶血 疾病预防：在G-6-PD缺陷高发地区，应进行群体G-6-PD缺乏症的普查;已知为G-6-PD缺乏者应避免进食蚕豆及其制品，忌服有氧化作用的药物，并加强对各种感染的预防。,注意事项： 1、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症是世界上最多见的红细胞酶病，据统计全球约有近4亿人G-6-PD缺陷。本病常在疟疾高发区、地中海贫血和异常血蛋白病等流行地区出现，地中海沿岸、东南亚、印度、非洲和美洲黑人的发病率较高。我国分布规律呈“南高北低”的
14、态势，长江流域以南，尤以广东、海南、广西、云南、贵州、四川等地为高发区，发生率为4%-15%，个别地区高达40% 2、全血标本中G-6-PD比较稳定，但溶血后极不稳定。若不能及时测定，将全血标本保存于4 ，可稳定数天。 3、年轻患者如红细胞计数正常，单纯G-6PD活性升高，一般无临床意义。,三、血红蛋白异常的检查,血红蛋白的组成 血红蛋白由血红素与珠蛋白组成 血红素：铁原子与原卟啉复合物。 珠蛋白：包括、和珠蛋白6种。 血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（Hb）组成不同。,Hb的种类 A.正常的Hb分三类 a.HbA(22)
15、b.HbF(22) c.HA2(22) B.异常Hb有两类 a.快速异常Hb:稳定Hb b.慢速异常Hb:不稳定Hb,三、血红蛋白异常的检查,血红蛋白电泳试验,异丙醇试验,1、血红蛋白电泳试验 原理：各种Hb的主要差异是组成珠蛋白的肽链不同，不同的肽链含有不同的氨基酸，因此具有不同的等电点，在PH的缓冲液中带有不同的电荷。在碱性缓冲液中，Hb带负电荷，反之带正电荷。肽链中一个或几个氨基酸被取代或缺失后，通常所带的电荷也随之发生改变。在电场中，带有不同电荷的珠蛋白分子分别向正极或负极移动，其迁移速度和带电荷的强弱相关。,常见血红蛋白电泳方法 1、醋酸纤维膜电泳 2、琼脂糖凝胶电泳 3、全自动Hb
16、电泳仪,醋酸纤维膜电泳主要过程琼脂凝胶电泳 RBC洗涤 制备溶血 点样 电泳 染色与脱色 扫描法 比色法:分区剪下色带，洗脱 分区切割色带,融化琼脂，干燥,透明比色,血红蛋白电泳设备,常见血红蛋白电泳方法 1、醋酸纤维膜电泳 2、琼脂糖凝胶电泳 3、全自动Hb电泳仪,全自动Hb电泳仪 目前国内使用的主要有 美国的Helena电泳仪、扫描仪和分析系统。 法国的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。 国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。 1.通过扫描定量给出HbA、 HbA2和HbF值。 2.异常区带通过查表确定。,毛细管电泳分离的血红蛋白定性区域 Z 15 : Hb H Z 14 : / Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore Z 12
