霉菌、酵母菌及空气检测

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1、食品中霉菌、酵母菌数的测定,由于遭到霉菌和酵母菌的侵染，食品和粮食常常发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。实验证明，一次大量食入或长期少量食入，皆能诱发癌症。目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌。,方法一、霉菌和酵母计数法,霉菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1 g或 1 mL 检样中所得的霉菌落数。,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：,一、 设备和材料,冰箱：2 5 ,恒温培养箱： 28 1 ,均质器,恒温振荡器,显微镜：10100,电子天平：感量 0.1 g,无菌锥形瓶:容量 500

2、mL、250 mL,无菌广口瓶：500 mL,无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度),无菌平皿：直径 90 mm,无菌试管: 10 mm75 mm,无菌牛皮纸袋、塑料袋,加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121 灭菌 20 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,1、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基,二、培养基,马铃薯(去皮切块) 300 g,葡萄糖 20.0 g,琼脂 20.0 g,氯霉素 0.1 g,蒸馏水 1000 mL,制法：,将马铃薯去皮切块， 加 1000mL 蒸馏水， 煮沸 10 min20 min。 用纱布过滤， 补加蒸

3、馏水至 1000 mL。,上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至 1000 mL，分装后，121灭菌20 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,2、 孟加拉红培养基,蛋白胨 5.0 g,葡萄糖 10.0 g,磷酸二氢钾 1.0 g,硫酸镁（无水） 0.5 g,琼脂 20.0 g,孟加拉红 0.033 g,氯霉素 0.1 g,蒸馏水 1000 mL,制法：,三、检验程序,检样,处理,稀释,平板分离培养,菌落计数,报告,四、操作步骤,1、 样品的采集,用灭菌工具采集可疑霉变食品 250 g，装入灭菌容器内送检。,谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等） 、发酵食品、乳及乳制

4、品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品 250g，装入灭菌容器内送检。,粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500 g 左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。,样品的稀释,在制备 10 倍系列稀释样品匀液时，用吸管反复吹吸 5 次,用吸管反复吹吸 50 次，使霉菌孢子充分散开。,根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 2 个无菌平皿内。,2、 接种,同时

5、分别取 1 mL样品稀释液加入 2 个无菌平皿作空白对照。,及时将 冷却至 46 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，每皿倒 15 mL20 mL，并转动平皿使其混合均匀。,3、 倒培养基,4、 培养,待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养 5d，观察并记录。,5、 菌落计数,肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。,霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。,选取菌落数在 10 CFU150 CFU的平板。,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。,菌落数应采用两个平板的平均数。,6、 结果计数,（

6、1）计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。,（2）若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。,（3） 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,（4） 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1计数。,7、 报告,（1） 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。,（2） 菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字

7、，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。,（3） 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。,方法二、霉菌直接镜检计数法,常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。,1、 设备和材料,折光仪,显微镜,郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片,测微器：具标准刻度的玻片,盖玻片,霉菌可以作为一种指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐烂存在。,2、 操作步骤,检样的制备：,取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460（即浓度为7.9%8.8%）

8、 ，备用。,显微镜标准视野的校正：,将显微镜按放大率 90125 倍调节标准视野，使其直径为 1.382 mm。,涂片：,洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。,按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。,观测：,将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察 50 个视野，同一检样应由两人进行观察。,结果与计算：,在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-）,第一节 空气洁净技术,1.空气微生物

9、的卫生标准及检测方法,室内空气中细菌总数规定撞击法4000cfu/m3;沉降法45cfu/皿。 （ GB/T17093-1997 ）,高效过滤器、紫外线消毒，空气熏蒸法（过氧乙酸）,空气检测技术和净化技术,检验环境中空气微生物检测,沉降法检测程序,采样器消毒-倒平皿 采样(30150L)- 恒温箱(361，48h） -计算菌落数（cfu/m3）,根据平板上所生长的菌落数计算出1m3或1L空气中的细菌总数。,空气中微生物的测定方法,灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、培养基,实验器材,自然沉降法,(1)将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒十五个平板，冷凝。 可以同

10、时检测空气中细菌、放线菌和霉菌浓度。,测定空气微生物的5点采样法,（2）在一定面积的房间内，按下图的5点所示，每种培养基每个点放三个平板，打开皿盖，暴露于空气中30分钟或60分钟后盖上盖子。 （3）肉膏蛋白胨平板于37，倒置培养1天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于28培养分别培养2448h各自计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。,（4）计算每m3空气中微生物的数量。 面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的细菌数。 奥氏公式：,式中：C空气细菌数； A捕集面积，cm2 ； t 暴露时间，min； N菌落数，个。,计算的浮游细菌数比实测的浮游细菌少。原因是此公式

11、没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流情况、人员密度和活动情况。,根据落菌数，记录空气中微生物的种类和相对数量，填写下表，推算出1m3空气中细菌数。 空气微生物的测定结果,例：对火车站候车室进行5min检测，皿底直径为9mm的平板经37 24h 后所生长的菌落数为76个；请计算火车站候车室空气的微生物浓度，是否超过标准？,公共场所空气微生物标准（GB）9673-1996,室外空气污染：应采取预防为主，防止污染源扩散，控制污水回用和生物固体利用中生物气溶胶的传播，如在污水曝气池上安装隔离塑料膜，改喷灌为滴灌，以减少含菌气溶胶的传播。同时，对再生污水利用前应适当消毒。,室内空气：某些特殊的环境需进行空气

12、净化与消毒，如洁净车间、微生物实验室、病房、外科手术室等。控制室内空气微生物污染常用下述几种方法。,2. 空气的净化与消毒,在洁净车间、微生物实验室等应尽量减少人员的数目和走动，减少开关门的次数，以防止将地面微生物扬起和外界微生物的带入。对表面应进行湿式清扫。被污染的器皿及时灭菌。,控制室内空气微生物污染常用下述几种方法。,(1) 控制污染来源,自然对流通风 开窗通风以排除空气中微生物。,湍流通风 效果优于自然通风，但远不及过滤层流通风。,过滤层流通风 过滤器中的过滤介质多为醋酸纤维，空气穿过滤过层，能除去小到0.3m的粒子，过滤后的空气沿平行线以均匀速度流动，根据需要可设计成垂直式或水平式层

13、流，可用于微生物操作的超净工作台、洁净病房和手术室。,(2) 物理通风法,除菌效果： 自然对流通风为17.4 % ， 湍流通风为 46.9 % ， 过滤层流通风为96.7 % 。,(3) 紫外线照射法,如紫外光照射的强度和时间得当，紫外光可以杀死几乎所有的传染因子，它更适用于手术室、病房、无菌实验室等处消毒之用。注意定期检测灯管照射强度，并注意人体的防护，防止臭氧污染。,使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油

14、垢，以减少紫外线穿透的影响。,(4) 化学消毒剂消毒,常用的空气消毒化学药品有过氧乙酸、过氧化氢、乳酸、三乙烯乙二醇、丙二醇、次氯酸钠、甲醛（福尔马林）等。,过氧乙酸的分解产物是乙酸、过氧化氢、水与氧，这些都对人体无害。其缺点是已稀释的过氧乙酸易分解，宜临用时稀释配制，此外高浓度的过氧乙酸溶液对金属和纺织品有一定的腐蚀作用。,喷雾法消毒用5 10 过氧乙酸溶液喷雾，如为80m3 的房屋用100200 mL，即可达到室内空气及物品表面消毒的目的。消毒后应密闭lh ，经通风换气后再进入。,应用过氧乙酸消毒空气，通常有两种方式：,熏蒸法消毒将过氧乙酸水溶液置于耐腐蚀的容器中加热，使其产生过氧乙酸蒸气

15、和水蒸气，使室内空气和物品表面达到消毒目的。过氧乙酸熏蒸用量为0.751g / m3 ，熏蒸后密闭lh 。,第二节 水中微生物控制技术,自来水厂常用的方法有： 加氯消毒、臭氧消毒、紫外线消毒和微电解消毒 。,1. 目前最常用的是加氯消毒-液氯或漂白粉 。,水中加氯后，生成次氯酸（HOCl）和次氯酸根（OCl-）。两者都有氧化能力，HOCl是中性分子，可能扩散到带负电的细菌表面，并渗入细菌体内，借氯原子的氧化作用破坏菌体内的酶，而使细菌死亡，而OCl-带负电，难于靠近带负电的细菌，所以虽有氧化能力，但很难起消毒作用。氯加入水中后,一部分被能与氯化合的杂质消耗掉,剩余的部分成为余氯。,(TJ20-

16、76)规定的余氯量只能保证杀死肠道传染病菌,即伤寒、霍乱和细菌性痢疾等几种疾病。一般说，当水的pH值为7左右，钝化病毒所需的游离性余氯约为杀死一般细菌的220倍，其用量随病毒的种类而异，并与水温成反比。杀死赤痢阿米巴需游离余氯310mg/L左右，接触时间30min。而杀死炭疽杆菌可能需投加更多的氯。,我国生活饮用水卫生标准(TJ20-76)规定,氯接触30min后,游离性余氯不应低于0.3mg/L。集中式给水处理厂的出厂水除符合上述要求外,管网末梢的水的游离性余氯不应低于0.05mg/L。0.05mg/L余氯这个数字大致相当于5万个细菌重量的1000倍,所以即使每升水重新繁殖出5万个细菌,0.05mg/L的余氯还足以杀死它们。,干燥空气放电时，部分氧气即转化为臭氧，浓度可达25mg/L左右。只能现场制备，不能像液氯那样工业化生产，因此在费用上常高于加氯消毒。,2. 臭氧消毒,