《分子生物学chapter-4-转录》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学chapter-4-转录（130页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Chapter 4 Gene Expression 基因表达 （1）,转录 Transcription,4.1 基本概念,转录模板 模板链（-），非编码链，反义链 非模板链（+），编码链，有义链,模板链（-），非编码链，反义链,非模板链（+），编码链，有义链,转录 - RNA合成,5,3,5,3,5,3,模板 ：转录成RNA的模板；,编码、有义 ： 其信息编码蛋白质的氨基酸顺序,4.1 基本概念,转录单位（Transcription Unit） 从转录启动子始到终止序列为止的一段DNA序列，它控制蛋白质或功能RNA的转录。 原核生物的转录单位 操纵子，多顺反子 真核生物的转录单位 单个转录单位
2、，单顺反子,不对称转录（Asymmetric Transcription） ： 对特定基因而言，转录时只使用其中一条链作为模板。 不对称转录的验证： 假设1：体内对称转录 假设2：体内不对称转录,4.1 基本概念,不对称转录的验证,小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV,变性，分别分离两条单链（+）链和（-）链并克隆至单链DNA的M13噬菌体,（+）链,（-）链,能杂交,体内对称转录为：,能杂交,不对称转录的验证,小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV,变性，分别分离两条单链（+）链和（-）链并克隆至单链DNA的M13噬菌体,（+）链,（-）链,体内不对称转录为RNA,不能杂交,能杂交,证实体内以不对称方式转录,转录过程
3、概述,4.2 原核生物的转录,启动子 原核生物启动子 RNA聚合酶 转录起始和转录终止,4.2.1 原核生物的转录启动子,启动子的发现与证实,（1975年， Pribnow, D. & Schaller, H.）,DNA,RNA polymerase,Treated with DNase,Extracting masked DNA,Sequencing,Pribnow box ( -10 box; -10区),足 迹 实 验,+1,C G/A T initiation site,上游upstream,下游downstream,17+1bp,原核生物的核心启动子 （Core promoter）,
4、-35区,-10区,转录起点,Unwound region,原核生物的扩展启动子 （Extended Promoter）,Extended promoter: Core promoter: Binding site for RNA polymerase UCE (Upstream control Element，上游控制元件; Up element, UP,上游元件 )：与CAP-cAMP结合，对基因转录进行正控制。,Fis sites: -170 -60 , Binding sites for transcription-activator protein Fis to enhance tr
5、anscription. Such sites are not classical promoter elements but act as enhancers.,转录启动子变异 （1）、-10区、-35区的碱基突变,上调（上行）突变： 启动子基序与标准基序没有差异或差异极小，启动转录的能力较强。 下调（下行）突变： 启动子基序与标准基序差异较大，启动转录的能力较弱。,野生型启动子基序,突变位点和类型,突变方向和程度,A/T G/C： 多为下行突变，增强了双链的稳定性，不易解链，导致转录效率下降。,A/T T/A：有上行突变，也有下行突变。这种突变改变了双链的碱基堆积或者与RNA聚合酶的结合能
6、力，导致转录效率改变。,-10区的碱基突变,-10区和-35区碱基突变,单独突变：-10区或-35区突变 转录效率下降 100倍 同时突变：-10区和-35区同时突变 转录效率下降1000倍,转录启动子变异 （2）、-35区与-10之间的间距的突变,间距长度：17 1 bp 间距趋近 17 bp 有利于RNA聚合酶的启动，上行突变； 间距远离 17bp 不利于RNA聚合酶的启动，下行突变。,4.2.2 原核生物的RNA聚合酶 DNA-dependent RNA polymerase （依赖DNA的RNA聚合酶，RNA Pol）,RNA聚合酶亚基的分离,Bergess, R and Traver
7、s, A., 1969 Separating the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS-PAGE,15 104,16 104,7 104,4 104,全酶,核心酶, 因子,Holoenzyme = Core enzyme + ,（全酶 = 核心酶 + 因子）,核心酶：通过静电作用与DNA分子非专一、非特异地结合，主要负责链的延伸。 因子：与核心酶结合，并使全酶构象改变，特异地与DNA结合。,杂交竞争实验,杂交竞争实验 检测T4噬菌体的RNA的生物合成,T4噬菌体,感染 E.coli,在感染后的不同时间点收集T4 噬菌体的转录产物RNA：1min
8、（immediate early gene）, 5min(delayed early gene), 10min(late)作为竞争者,与3H标记的3种类型的噬菌体RNA构成竞争对进行杂交竞争实验,的功能,acts as a specificity factor,核心酶可以非特异地识别和结合模板DNA。 当因子和核心酶一起构成全酶时，可以提高RNA聚合酶对模板DNA特定区域的结合常数。 因子指引RNA聚合酶结合到转录启动子上。,Biological Process,70,32,54,general,Heat shock,N metabolism,TTGACA TATAAT,TCTCNCCCTTG
9、AA CCCCATNTA,CTGGNA TTGCA,factors specificity is in harmony with genes, development stages or tissues.,Consensus Sequence,因子特异性的表现,RNA聚合酶其它亚基的功能, : recognize and bind to the template un-specifically,: unwind the double-strand,: recognize and bind the template specifically,: nucleotides binding durin
10、g initiation and elongation,4.2.3 原核生物的转录起始 Promotion of Transcription in Prokaryotes,（特异识别和结合，形成封闭的起始复合物）,（识别-10区，形成开放的起始复合物）,ATP or GTP,原核生物的RNA聚合酶全酶的各种亚基依次发挥其功能，共同起始转录。,回顾,原核生物启动子的主要元件及其保守序列特征 启动子的 上调突变 vs.下调突变 原核生物RNA聚合酶各亚基的功能特征及其在转录起始中的作用,4.2.4 原核生物的转录终止 Termination of Transcription in Prokaryo
11、tes,原核生物中两种转录终止子,共同特征：反向重复的GC丰富区,GCGGUAGUCC,CGCCAUCAGG,GCGGTAGUCC,CGCCAUCAGG,转录,RNA,稳定的发夹结构造成暂停，导致RNA聚合酶继续合成RNA的障碍。,Transcript,Template,不依赖因子的终止子,不依赖因子的终止子的特征,依赖因子的终止子, factor: Moves along the nascent RNA towards the transcription complex Hydrolyzes the ATP to energize the moving Helicase,依赖因子的终止子的特
12、征,4.3 真核生物的转录,真核生物RNA聚合酶 真核生物转录启动子 真核生物的转录启动,顺式作用元件 vs. 反式作用因子,Target Gene,cis-element 顺式元件,Gene,调控基因表达,调控基因表达,作为反式因子（trans-factor）调控基因表达,基因转录的调控,顺式作用元件：,反式作用因子：,启动子,增强子/沉默子,RNA聚合酶,转录因子,Cis elements,Trans factor,4.3.1 真核生物的RNA聚合酶,种类和特性,RNA 聚合酶可视为调控转录的反式作用因子 根据其对-鹅膏覃碱的敏感度区分为： RNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶,不敏感
13、,低浓度敏感,高浓度敏感,5s rRNA gene, tRNA gene,nucleoplasm （核质）,all genes encoding protein, some encoding U-RNA,nucleoplasm（核质）,rRNA gene cluster (except 5s rRNA gene),Nucleoli (核仁),Transcribed Genes,Location,RNA Polymerase,3种RNA聚合酶分别转录不同的基因类别：,3种RNA聚合酶组成,均具有3个大亚基（RPB1 RPB2 RPB3)和7-12个小亚基 彼此间同源性 78%,RPB1 RPB2
14、 RPB3 ,RPB2 有一柔性的C末端结构 (CTD), 含有7个氨基酸 重复序列，其中Ser 和 Thr 可被磷酸化,RPB2 的 三种亚型 ： IIA,磷酸化,IIO,水解,IIB,4.3.2 真核生物的转录启动子和转录起始,转 录 启 动 子 （是调控基因转录启动的顺式作用元件）,对应于不同的RNA聚合酶，有3种类型的真核基因及其转录启动子 Pol转录的基因 Pol转录的基因 Pol 转录的基因 转录启动子由两部分组成 核心启动子（基本启动子） 上游激活序列（Upstream Activating Sequence, UAS）或称上游启动子元件（Upstream Promoter El
15、ement, UPE）,Pol ： rRNA gene cluster,Note: NTS = non-transcription sequence,Ribosome RNA genes,Class promoter,Upstream Control Element (UCE, 上游控制元件）; Core promoter (核心启动子),The sequences of class promoters diverse among species But， the organization of core promoters and UCEs are conserved.,Pol I promoters,Class promoter-directing Initiation,UBF,UBF,UBF-upstream binding factor SL1-selectivity factor,SL1： TBP PolI-specific TBP associated factors,Pol gene & Class Promoter,Pol ,More than 16 subunits,+1,内启动子,A box +50
