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1、 2环糊精流动相添加剂法拆分特非那丁对映体吴永江 3 1 ,2 方昕 2 朱妙琴 31 (浙江大学制药工程研究所 ,杭州 310027) 2 (浙江大学药学院 , 杭州 310031)3 (浙江教育学院 ,杭州 310012)摘 要 以 2环糊精为手性流动相添加剂 ,于 C18反相柱上建立了特非那丁手性对映体的高效液相色谱拆分方法。探讨了 2环糊精浓度、有机修饰剂种类及含量、流动相 pH等因素对特非那丁对映体拆分的影响 ,结果表明 :当流动相为高氯酸钠溶液 (0. 08 molPL)乙醇二乙胺 (75 25 0. 5) , pH 6. 2 ,含 2环糊精浓度为 25 mmolPL时特非那丁对映
2、体得到良好分离。关键词 特非那丁 ,对映体分离 ,反相高效液相色谱法 , 2环糊精 ,流动相添加剂2002204209 收稿 ;2002209226 接受本文系国家自然科学基金资助项目 (C39770868)1 引言特非那丁 (terfenadine)是一种非抑制性 H1 受体拮抗剂 ,通常用于治疗哮喘、鼻炎等过敏性疾病。特非那丁的分子结构中含有一个手性碳原子 ,但目前临床上以消旋体给药。近年来的研究证明 :该药物在体内的代谢具有立体选择性 , Terhechte 等 1 对志愿者以消旋体给药后 , 发现 R 型对映体的血药浓度较高 ,而尿样中 R 型与 S 型代谢物的浓度却相近。为了研究药物
3、氧化代谢的主要酶系 肝 P450 酶与特非那丁对映体的立体选择性代谢关系 ,作者试图寻找一种合理方便的特非那丁对映体拆分方法。迄今为止 ,关于特非那丁对映体拆分的相关报道不多 ,主要使用的方法为手性固定相法。 Zamani 等 2 采用卵类粘性蛋白质手性柱法分析了血浆中特非那丁对映体及其羧酸代谢物的浓度 ;Surapaneni 等 3 采用手性 AGP 柱拆分了特非那丁对映体 ;Weems 等 4 用 2环糊精手性固定相法进行了特非那丁对映体的拆分。手性固定相法虽然操作简单 ,但手性柱价格昂贵 ,使用寿命短 ,消耗大。本文采用 2环糊精为流动相添加剂 ,以 C18柱为固定相 ,用反相高效液相色
4、谱法对特非那丁手性对映体进行了拆分研究 ,并对一些影响因素进行了探讨 ,得到了理想的分离效果。2 实验部分2. 1 仪器与试剂LC210ATvp 高效液相色谱仪 (日本岛津公司 ) ;SPD210Avp 紫外检测器 ;Rheodyne 7725 型手动进样阀 ,N22000 色谱工作站 (浙江大学智能工程研究所 ) ; PHS29V 型酸度计 (杭州华光无线电厂 ) ,METTLERAE260 电子天平。特非那丁 (扬州制药厂 ) ; 2环糊精 (AR ,中国医药集团上海化学试剂公司 ,精制后使用 ) ,甲醇、乙醇(AR ,杭州化学试剂厂 ) ;乙腈 (分光光度纯 ,浙江临海浙东特种试剂厂 )
5、 ;NaClO4 (上海化学试剂总厂 ) ;尿素 (宁波市化学试剂厂 ) ;二次重蒸水。2. 2 色谱条件色谱柱 :Shimadzu VP2ODS(5 m , 150 mm 4. 6 mm) ,保护柱 :Shimadzu shim2pack ODS ;流动相流速 :015 mLPmin ;紫外检测波长 :210 nm ;柱温 :室温 ;进样量 :20 L。2. 3 特非那丁溶液 ( 40 mgPL)的配制精密称取特非那丁 0. 0020 g ,置于 10 mL 量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀后于 4 避光保存 ,作为储备液。吸取储备液 0. 2 mL ,加流动相至 1 mL ,振荡混
6、匀即得 ,进样前用 0. 45 m 微孔滤膜过滤。第 31 卷2003 年 3 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第 3 期332 3353 结果与讨论3. 1 流动相组成以 2环糊精为流动相添加剂拆分手性化合物时 ,常常需添加盐以及有机改性剂以改善峰形与分离度。通过实验发现 ,高氯酸钠溶液 (0. 08 molPL)乙醇二乙胺 = 75 25 0. 5 ( VPV) , pH 6. 2 , 2环糊精浓度为 25 mmolPL 为最佳的流动相配比。在该条件下 ,特非那丁对映体良好分离 ,典型色谱图见
7、图 2。 R ( + )图 1 特非那丁对映体色谱图Fig. 1 Chromatogram of terfenadine enantiomers型特非那丁对映体的保留时间为 51. 7 min ; S ( - )型特非那丁对映体的保留时间为 55. 3 min。3. 2 高氯酸钠浓度的影响在 2环糊精手性流动相添加剂法中 ,适量的盐有利于对映体的分离。本实验中曾试用过几种无机盐 ,结果以 NaClO4 的效果最佳。在 0. 02 0. 12 molPL范围内改变 NaClO4 浓度 ,发现特非那丁对映体的容量因子随着盐浓度的增加而降低 ,分离度逐渐增大。这是因为盐的存在能增加包合物的稳定性 ,
8、提高手性识别能力 ,同时盐的存在有利于提高 2环糊精的溶解度。但盐浓度太高对液相色谱系统有损害。综合考虑各种因素 ,本实验选择 NaClO4 浓度为 0. 08molPL。3. 3 2环糊精浓度对拆分的影响及保留机理 2环糊精浓度对手性分离起着重要的作用 ,一般随 2环糊精浓度的增加手性对映体分离度增大。特非那丁分子中的手性碳原子上包含有一个苯环 ,能够嵌入 2环糊精内腔 ,发生手性包络作用 ,产生较大的包结络合差异 ,并且手性碳原子上的羟基能够与 2环糊精腔体上的羟基结合成氢键产生相互作用。 2环糊精浓度的增加有利于增强它与对映体之间的相互作用 ,因而使得对映体之间的色谱行为差异扩大 ,提高
9、分离度。比较含不同浓度 2环糊精的流动相分离结果可知 ,随着 2环糊精浓度的提高 ,容量因子迅速降低 (见表 1) ,分离度增大 (见图 2) 。 2环糊精浓度在 20 30 mmolPL 时 ,特非那丁对映体分离良好。但 2环糊精浓度太高时 ,由于溶解度的限制 ,会影响其在流动相中的溶解 ,使流动相变浑浊。根据 Armstrong 报道 5 , 2环糊精作为手性流动相添加剂拆分手性药物对映体时 ,如果被拆分的物质只与 2环糊精形成 1 1 的包合物时 ,并且假设 2环糊精以及包合物不被固定相所保留 ,则溶质的 1Pk 对 2环糊精浓度作图时应该为一直线。本文的 1Pk 2CD 为一非线性关系
10、 (见图 3) ,说明固定相对 2环糊精以及包合物存在较强的吸附作用。因为 Shimadzu VP2ODS固定相未经封端处理 ,在其表面仍有较多的硅羟基存在 ,它们对 2环糊精以及包合物的吸附作用不能忽略。表 1 2环糊精浓度对特非那丁对映体分离的影响Table 1 Effects of 2cyclodextrin ( 2CD) on separation of terfenadine enantiomers 2环糊精浓度Concentration of 2CD(mmolPL)容量因子 ( S 型 )Capacity factork ( S)容量因子 ( R 型 )Capacity facto
11、rk ( R)分离度ResolutionR选择因子Selective factor15 36. 36 33. 78 0. 95 1. 0720 29. 32 27. 32 1. 19 1. 0725 24. 81 22. 83 1. 34 1. 0930 15. 04 14. 08 1. 28 1. 073. 4 有机修饰剂种类与用量的影响在实验过程中我们曾尝试在流动相中添加乙腈 、甲醇、乙醇等有机修饰剂以改善分离。结果表明 :在低浓度的 2环糊精存在下 ,这 3 种修饰剂对特非那丁对映体的容量因子的影响相差不大。保持 2环糊精浓度为 25 mmoLPL ,加入乙腈、甲醇时流动相中出现明显的白
12、色絮状浑浊物 ,加热后浑333第 3 期 吴永江等 : 2环糊精流动相添加剂法拆分特非那丁对映体 图 2 2环糊精浓度对分离度的影响Fig. 2 Effect of concentration of 2CD on resolution ofterfenadine enantiomers图 3 2环糊精浓度对容量因子的影响Fig. 3 Effect of concentration of 2CD on capacity factor浊不能完全消失 ,而乙醇作为有机修饰剂的流动相仍保持澄清。可见 ,乙醇的存在对高浓度的 2环糊精有一定的增溶作用并能够改善峰形。因此 ,我们在实验过程中选用乙醇作为流
13、动相的有机修饰剂。在 2环糊精浓度为 25 mmolPL ,流动相 pH为 6. 2 , 不添加乙醇的情况下 ,体系在 200 min 内未检测到特非那丁对映体与环糊精包合物的色谱峰。随着乙醇浓度的逐渐增大 ,手性药物色谱峰的容量因子呈逐步减小的趋势 (图 4) ,但同时对映体分离度有所减小 (图 5) 。这可能是由于乙醇的存在减小了特非那丁环糊精包合物与固定相的吸附所致。通过实验发现 ,以 2环糊精作为流动相添加剂时 ,有机修饰剂乙醇的浓度在 25 % 35 %比较适宜。图 4 乙醇浓度对容量因子的影响Fig. 4 Effect of ethanol on capacity factor o
14、f terfenadine图 5 乙醇浓度对分离度的影响Fig. 5 Effect of alcohol on resolution of terfenadineenantiomers3. 5 尿素对对映体分离的影响尿素是一类常用的 2环糊精增溶剂。由于本实验中采用较高浓度的 2环糊精 ,该物质极易在流动相中析出 ,对高效液相分析系统损害极大 ,因此 ,我们试图在流动相中加入尿素增加溶解度。流动相中分别添加入 0. 3、 0. 6、 0. 8 和 1 molPL 浓度的尿素 , pH值分别在 2. 2、 3. 2、 4. 2、 5. 2、 6. 2 以及 7. 2 的条件下进行实验 , 发现效
15、果不佳 ,在 120 min 内均未检测到对映体峰。故在本实验中未添加尿素。3. 6 酸度的影响特非那丁为弱酸性药物 , 一般来说 ,减小酸度通常有利于酸性药物的分离。为此 ,在实验过程中 ,我们选取 pH 7. 18、 6. 20、 5. 07 及 4. 0 进行了实验 ,发现在 pH 4. 0 和 5. 07 时分离效果差 ,而在 pH 7. 18、6. 20 条件下 ,对映体分离度较好 ,故本实验选择 pH 6. 20。3. 7 二乙胺的影响二乙胺是常用的色谱修饰剂之一 , 能够显著改善色谱峰对称性 , 减小拖尾峰 , 本文加入二乙胺后 ,对映体峰明显改善 ,并且分离度随着二乙胺浓度的增加而增大 ,并达到良好拆分。433 分 析 化 学 第 31 卷References1 Terhechte A , Blaschke G. J . Chromatogr. A , 1995 , 694 (1) :219 2252 Zamani K, Conner D P , Weems H B , Yang S K, Cantilena L R. Chirality , 1991 , 3 (6) : 467 4703 Surapaneni S , Khalil S K. Chirality , 1994 , 6 (6) :479 4834 Weems H , Zamani K. Chiral
