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1、实验十一 组织培养与病毒的细胞感染法,练习内容 1鸡胚纤维母细胞培养法（示教） 2病毒的空斑形成试验（示教） 3致细胞病变作用的观察（示教）,目的要求 1了解细胞培养的原理与方法 2了解病毒空斑形成试验方法与意义 3了解病毒对细胞致病变作用的类型。,一、单层细胞培养法 （一）鸡胚纤维母细胞培养法 （二）人胚肾细胞培养法 二、人双倍体细胞培养法 双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而直保持其双倍染色体的单层细 胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾,三、传代细胞培养法 传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双 倍体细胞转化而来，实验室常
2、用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如Hela细胞，KB细胞、 HEP2细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间 隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮 四、器官培养,五、病毒的细胞感染法 在单层 细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验. 六、细胞致病作用的观察 细胞致病作用也称“细胞病变作用” （Cytopathic-effect，CPE），根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。,（一）全变型 指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞
3、发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。 （二）包涵体型 有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见表133）。 （三）融合型 有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。,【结果观察】 纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度： （） 无细胞病变； （+） 25以下的细胞有病变作用； （+） 一50的细胞有病变作用； （+） 一75左右的细胞有病变作用； （+） 一75以上的细胞有病变作用；,某些病毒引起细胞病变的主要特征(表132 ),实验十四 病毒的血清学试验,血清学试验的方法很多，一股实验室最常用的是中和试验，补体结合试验和红细胞
4、 凝集及凝集抑制试验。近年来免疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接红细胞凝集试验、 琼脂扩散试验以及红细胞吸附抑制试验等技术，也成为实验室病毒诊断的常规技术。,练习内容 1病毒的血球凝集试验 2病毒的血球撬集抑制试验,目的要求 1了解病毒的血清学试验方法与原理 2掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读 血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。,三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验,某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特
5、异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点 .这里我们以新鸡城瘟病毒 NDV为例介绍血凝和血凝抑制试验。,【材料】 新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1份 0.5鸡血球悬液 1管 生理盐水或PBS 1瓶 96孔微量血清盘 1块 微量稀释棒 1支 无菌试管 1支,【方法】 1在微量血清盘的末孔标记为对照孔。 2各孔中加生理盐水25微升。 3取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即110稀释）。 4取110病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸2
6、5微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次依次稀释，直至第9孔弃去25微升。 5各孔中加0.5鸡红血球25微升充分摇匀。 6置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。以45分钟为准。,新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5 ),25,25,25,25,25,25,25,25,【结果判读】 各孔出现的血球凝集程度以+、+、+、+、+、表示。 +为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底； +约有50血球发生凝集； +约有50血球发生凝集； +约有25血球发生凝集； 不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘光滑，圆润。 血凝试验的结果以50血球凝集（+）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即
7、为1个血凝单位。,血球凝集抑制试验,【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。,【方法】 1血凝素单位的配制和调配 2住微量血清盘上编号，并设血清对照、病毒（血凝集）对照和血球对照孔然后211孔中各加生理盐水或PBS25微升。 3将110血清加入1、2、9孔，并从第2孔起作一系列倍比稀释至11280或更高的稀释度，每孔为25微升。 4按操作简表加入4单位血凝集。,6混匀，在室温下作用20分钟。 7各孔中滴加0.596鸡血血球悬液50微升。 8在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球对照孔中滴加生理盐水或PBS各25微 升。 9混匀后，在室温下静止，30分钟，60分钟各观察一次结果。一般
8、以60分钟结果为准，但如果血球下滑显著，则以30分钟结果判读。,25,25,25,25,25,25,25,1根据各孔血球凝集程度，以“+、+、+、+，”表示。 2查看各对照孔：血清对照不凝集（）：病毒对照为完全凝集（+），血球对照则应不凝集（）。 3以出现完全抑制血球凝集（即不凝集）的最高血清稀释度为其最终滴度。例如 稀释倍数：110 l20 140 l80 1160 1320 l640 11280 结 果： + + + 此血清血凝抑制滴度为1160，结果判读】,实验十五 病毒的快速诊断,目的要求 1初步掌握电镜下病毒的基本形态 2了解ELISA的原理、方法及结果判读,练习 ELISA,酶联免
9、疫吸附试验,（Enzyme Linked immunosorbent assay， ELISA） ELISA是当前各实验检测抗原抗体最常用的方法之一，也是进行病毒快速诊断的重要手段。它具有灵敏度高（109一1012克），特异性强、操作简便、易于观察、便于现场大规模检查。,ELISA的种类有许多种，但用于病毒快速诊断常用间接法和双抗体夹心法,（一）间接法（indirect method）,1抗原包被 纯化抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加100微升，置湿盒中4过液，洗涤三次。 2加待捡血清 每孔加100微升适当稀释的待检血清，置湿盒中，372小时。洗涤三次。 3加酶结
10、合物 每孔加100微升酶标记抗人Ig，置湿盒中，372小时。洗涤三次。 4加底物 每孔加底物100微升，置湿盒，3730分钟。 6加终止液100微升。 6读取结果。,（二）双抗体夹心法（Double antibody sandwich method）,1抗体包被 已知抗体用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至110微克毫升，在微量凹孔板上，每孔加100微升包被，置湿盒4过夜。洗涤三次。 2加待检标本 每孔中加含抗原的待检标本100微升置湿盒37小时。洗涤三次。 3加酶结合物 每孔加酶标记的特异性抗体100微升置湿盒37小时。洗涤三次。 4加底物 5加终止液 6读取结果,【结果判读】 用酶标测定仪测在492nm下各标本光密度OD值。 ELISA的结果易受到各种因素影响，因此每次试验（每一块试验板）都设阳性对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对照OD值1.0，阴性对照OD值0.2，结果用PN值表示。 P/N值1.5-2.1者为可疑 PN值1.5为阴性 PN值2.1者为阳性,
