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1、第三章 凝胶分离技术,凝胶是一种高分子聚合物，不溶于水，但遇水溶胀，形成三维空间结构。凝胶又称分子筛，对生物大分子物质具有筛分作用。凝胶分离即是利用凝胶分子筛的筛分作用对物质进行分离的操作。,优点： 1、凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，产物收率高，重现性好； 2、应用范围广，所分离物质分子量覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的物质； 3、设备简单，操作方便，周期短，可反复使用。凝胶分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质（蛋白质、酶、核酸、激素、多糖等）的制备与生产技术中被广泛应用。,第一节 凝胶分离原理,一、凝胶分离原理当被分离物质的分子大小不同
2、时，能够进入到凝胶内部的能力也不同。凝胶中的孔隙大小与分子大小有相仿的数量级。当混合物通过凝胶时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子就不能进入，因此在移动速度方面就出现差异，从而使不同相对分子质量的各组分得到分离。,分离原理可用下式表示：VR = V0 + kVi 式中：VR：保留体积（洗脱体积）V0：柱床内存在于凝胶外面的水相体积外水体积Vi：凝胶颗粒内部所含的水相体积内水体积k：分配系数,被分离物质分子很大，被完全排阻于凝胶颗粒之外： k = 0，VR = V0 ；被分离物质分子很小，能完全自由进入凝胶颗粒内部：k =1，VR = V0 + Vi ；中等大小的分子，只能达
3、到部分凝胶颗粒内部：0 k 1，V0 VR V0 + Vi。,Vo、Vi的测定Vo的测定选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。 Vi的测定选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定。,分配系数k的计算：k = （VR-V0）/ Vi,分子量与洗脱体积的关系： lgMr=-kVR+Vo（成立？）Mr很大时，达到上限？ Mr很小时，达到下限？,二、常用凝胶 葡聚糖凝胶(dextra
4、n gel，Sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，Bio-Gel P) 琼脂糖凝胶(agarose gel，Sepharose) 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex)此外还有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝胶,1、葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亚枫等溶剂中都可吸液膨胀, 但吸收溶剂的量与膨胀后的体积视溶剂而异。凝胶充分膨胀的时间随交联度而不同, 交联度越小所需时间越长, 加热可以缩短吸水膨胀时间。,葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。Sep
5、hadex G-10，15，25，50，75，100，150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。,葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶只能应用于水溶性物质与水溶液或类水溶液, 但如在葡聚糖分子上引入有机基团则可以增大其有机性质而使之呈亲脂性。如LH-20型葡聚糖凝胶即为在G-25型凝胶上引入羟丙基基团, 使糖分子与醚链相连。这种凝胶既有亲水性, 又有亲脂性, 可以在多种有机溶剂中膨胀后应用, 如氯仿、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等, 但在苯、乙酸乙酯等溶剂中膨胀不多, 较少应用。用氯仿时,因凝胶比重较小, 所以要采取措施, 使凝胶不能浮
6、起, 也可改用上行法。,2、聚丙烯酰胺凝胶,3、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶与前二种不同, 它不是以化学键共价键交联的, 而是以氢键交联, 不同的孔隙程度是由改变琼脂糖的浓度而达到的,因此稳定性有一定限制。没有干的凝胶, 必须在膨胀状态保存, 遇脱水剂、冷冻和有机溶剂即破坏。pH在4-9之间、温度在0-40之间稳定, 超出此范围即破坏。,三、凝胶特性参数 1、排阻极限：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量，即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为Vo。如Sephadex G50的排阻极限为30000。2、分级范围：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分
7、子质量范围。如Sephadex G50的分级范围为1500-30000。,3、凝胶粒径：凝胶一般为球形，其粒径越小，HETP（理论板当量高度）越小，分辨率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。如软粒凝胶一般为50-150微米（100-300目），硬粒凝胶一般为5-50微米。4、空隙体积：指柱中凝胶之间空隙的体积，即Vo。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，如相对分子质量为200万的水溶性蓝色葡聚糖。,5、溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率，即溶胀率=100%如Sephadex G50的溶胀率为500%30%。6、床体积：指1克干胶充分溶胀后所占有的体积。如Sepha
8、dex G50的床体积为9-11mL/g干胶。凝胶的床体积可用于估算装满一定体积的凝胶柱所需的凝胶干粉量。,第二节 凝胶分离应用,凝胶分离特点(1)溶质与介质不发生相互作用，操作条件温和，回收率可接近100%； (2)批次之间不需要进行苛刻的介质清洗或再生，容易实现循环操作； (3)分离机理简单、操作参数少、容易规模放大； (4)仅根据分子量进行分离，选择性较低，处理量小。,一、凝胶的选择与处理 1、排阻范围的选择,2、粒度的选择,3、凝胶用量的选择干凝胶用量（g）：r2h/床体积 理论用量（1+10%）=凝胶处理量,4、凝胶的处理 （1）除去影响流速的过细颗粒“水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的
9、凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。 （2）溶胀使用前需直接在欲使用的洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，12小时即可。 沸水溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排除气体。,（3）为了保证流速稳定，获得较好的实验结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致。,5、柱结构（、h）的选择,柱太短，影响分离效果；柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当：内径过细（小于1cm），会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流
10、速影响分离效果；过大（大于5cm）则稀释现象严重。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例：对于除盐来说应为15125；对于纯化蛋白质来说应为1201100。,二、凝胶分离操作技术 1、凝胶装柱将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；向柱中加入约1/3体积的0.9NaCl溶液（或洗脱液）；将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2min。连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。 注意：防止空气进入凝胶床,装柱操作注意事项：灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不
11、能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象，可以用玻璃棒将已经形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的地方，再继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好凝胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来，所以使用前应用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖2000（Blue dextran-2000）通过凝胶柱，以检查形成的带色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。,注1：刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶柱会产生大量的气泡影响层析。 注2：在
12、整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气，在加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 注3：装好的凝胶柱，使用时应该用相当于柱体积两倍或更多的洗脱液流过洗脱柱，以压实凝胶。,2、样品的上柱及洗脱 加样量的控制分析：1-2ml/100ml床体积，制备：10-30ml/100ml床体积 洗脱液的选择：首先洗脱液最好与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果；水溶性物质的洗脱用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液，非水溶性物质的洗脱用有机溶剂（苯、丙酮等）。,葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离的物质发生反应，所以分离的效果较好
13、。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐作洗脱液。,凝胶层析加样操作示意图,图注： 1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。 3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入34mL洗脱液于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收集记录。,凝胶分离洗脱与自动收集系统,实物图,凝胶层析中的分离行为 蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红
14、色）、铬酸钾(黄色),3、凝胶的回收与保存凝胶一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02的叠氮化钠，在下次层析前将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70、90、95乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。,三、影响凝胶分离的因素 1、流速对蛋白质分辨率的影响,2、黏度对分辨率的影响,3、凝胶柱层析操作压操作压的增加会影响流速（变快？变慢？），此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床
15、容积的改变，相应测出的Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。,操作压与流速的关系,4、加样量对分辨率的影响I .加样量少时，A、 B二种物质完全分开。II.加样量适当时， A、B 二种物质刚刚 分开。 III.加样量太大时， A、B二种物质只能 部分分开。,（1）分析工作时，样品体积为柱床体积的14%；制备分离时，样品体积为柱床体积的2530%。 （2） 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2）当样品体积Vsep时，两个相邻组分不能完全分离。,5、凝胶粒径对分辨率的影响粒径小的分离较好, 分辨度较高, 但流速低；粒度大的流速高, 但洗脱峰较为扁平, 分辨度也较差。 从分析角度考虑, 以用较
16、细颗粒与较慢流速为好。,四、凝胶分离的应用主要应用范围： 分级分离各种抗原与抗体； 去掉复合物中的小分子物质，如除盐、荧光素和游离 的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片； 分析血清中的免疫复合物； 分子量的测定。,脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25-30，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。,用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。,
