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1、高效液相色谱质谱（HPLC-MS）联用技术,HPLC-MS简称LC-MS,HPLC-MS是近些年出现的联用仪器，发展非常迅速，弥补了GC-MS只能测定挥发性或半挥发性物质的不足，使色谱质谱联用技术得到了完善。GC-MS由于接口技术技术难度相对较小，因此，开发使用较早，而HPLCMS接口技术技术难度较大，开发使用较晚。 HPLC-MS所提供的信息与GC-MS相同（TIC、MC、SIM、全扫描三维图等）。,一、概述,HPLC-MS的特点：,MS作为LC的检测器不仅能得到色谱数据，如：峰保留时间、峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下：1、质谱为通用性检测器，可测定不带生色团或荧光基团的化合
2、物；2、质谱也是选择性检测器，用选择离子检测可一次完成定性、定量分析，且灵敏度很高。,3、提高鉴别化合物的可信度；可准确分析色谱峰的纯度；确定分子量。4、可分析不适合GC-MS分析的亲水性强、热不稳定及生物蛋白化合物。5、在线分析，免去了色谱组分的收集，减少样品损失，缩短工作周期。6、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。7、采用碰撞诱导解离技术(CID)以及多极质谱等可提供丰富的化合物结构信息。,由于HPLC目前的应用极其广泛，特别是在我们药学专业应用更为普遍，所以LC-MS在使用上比GC-MS有更高的使用价值。,与GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。另外，LC-MS一般用
3、来分析挥发性差，热不稳定的样品，应用范围增大。非极性化合物不能分析。（难以离子化）,二、LC-MS的工作原理,1. 接口的重要性接口是HPLC与质量分析器之间的过渡装置并承担着离子化的任务。由于MS需在真空下操作，以便完成离子形成、分离、检测的过程。但是HPLC出口含有大量的流动相（溶剂）（0.22mL/min）。 大量的流动相不得进入MS？HPLC的流动相处在高压下，液体气化成气体，其膨胀系数约为1000倍以上。1mL流动相液体可气化成1000mL气体。流动相的去除是接口的主要任务之一。 不如GC-MS接口成熟，历史较短。,三、LC-MS的接口,2. 接口的种类（离子化方法） 热喷雾 快原子
4、轰击（FAB） 电喷雾(API-EI、ESI) 大气压化学源(API-CI、APCI) 大气压光电离源(APPI) 粒子束, 电喷雾,电喷雾接口（ESI）工作原理:三个步骤：a、带电液滴的形成； b、溶剂蒸发和液滴碎裂；c、离子蒸发形成气态离子,a、带电液滴的形成,色谱流出物经毛细管顶端喷出，形成扇状喷雾，再38kV的高电场作用下，形成高度电离、含有溶剂的试样微小液滴。,b、溶剂蒸发和液滴碎裂,液滴与干燥气作用，在干燥气的作用下，溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，造成液滴表面的离子密度越来越大，当达到Rayleigh限时，液滴表面电荷产生的排斥力与液滴表面的张力大致相等，液滴非均匀破裂，分裂成更小
5、的液滴，更小的液滴继续重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂的过程。,电喷雾接口（ESI）工作原理:,c、离子蒸发形成气态离子,当液滴分裂至小于10nm时，其表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用导致部分离子从液滴表面蒸发出来，最终以单电荷或多电荷离子形式从液滴中转移至气相，形成气相离子。,N2气流干燥,Charged Droplets,电喷雾接口（ ESI）液滴变化示意图:,从毛细管喷出 （在38kV电场作用下）,气态试样离子,Rayleigh限,10nm,参见备注,以上过程是在大气压条件下进行的，在强电场驱使下，电离的溶质离子通过一个金属毛细管进入真空区，并电场作用不断加速聚焦进入质量分析器。,ESI
6、的垂直模式：,电喷雾接口的特点:主要给出准分子离子信息，（例如M+H、M+Na 、MH、 MNa等），以及大量的多电荷离子，而较少给出化合物的碎片离子；常用于强极性化合物及高分子化合物的测定，一般不适于非极性或弱极性化合物的分析； 由于温度较低，因此较适用于热不稳定化合物；只能允许非常小的液体流量（0.21mL）。, 大气压化学源(API-CI、APCI),大气压化学源 工作原理与ESI相似，所不同的是通过电晕放电针首先使溶剂离子化，离子化的溶剂与待分析物气态分子发生离子交换反应，形成准分子离子，使分析物离子化。,150,Sol+H+M MH + Sol （质子转移）或 Sol+HM MH S
7、olSol+M M+ Sol或 Sol MH M SH （质子抽出）,很少产生碎片，离子流集中在几种离子形式（一般为准分子离子），所以灵敏度高。信息量少。适用于有一定挥发性的中等极性或弱极性的样品，分子量2000以下。允许使用流速高及含水量高的流动相；极易与RPHPLC匹配。,特点：,1. 接口的选择,四、 LC-MS分析条件的选择和优化,ESI和APCI是两个最常用的接口，他们各自有优缺点但相互补充。,ESI的优势：适用于中等到强极性物质的测定；而弱极性或非极性物质无法测定；,APCI的优势：适用于弱极性物质的测定。也可分析非极性化合物，但灵敏度较低。,（1） 正离子模式,由在溶液中能够形成
8、的离子极性决定离子的极化方式。,如果在溶液中能够形成的离子为正离子，如碱性物质，则离子化模式选择为正离子模式。得到的准分子离子一般为M+H，其他也较常见的如M+Na 、 M+NH4 、 M+Na+CH3OH 、 M+H+CH3OH 等。,2. 正负离子模式的选择,正离子模式一般用乙酸（pH34）或甲酸（pH23）对样品进行酸化，若样品的pK值已知，pH至少低于pK值2个单位。,（2） 负离子方式,如果在溶液中能够形成的离子为负离子，如酸性物质，则离子化方式选择为负离子方式。得到的准分子离子一般为MH 。,负离子模式可以用氨水或三乙胺对样品进行碱化，pH至少高于样品pK值2个单位。,对于酸碱性不
9、明确的物质，可以先使用APCI（+）模式进行预试。,（1）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及易挥发盐的缓冲溶液。,3. 流动相的种类及流量的选择,若流动相需用缓冲溶液，该缓冲液最好具有挥发性，这样可减少缓冲盐在离子源内的沉积。,应当根据样品所需的极性以及样品的pH值，调节流动相的pH。,蛋白酵素,流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以增强离子的解吸作用，离子化效率提高。,（2）流速：和色谱柱的内径有关，内径越小流量越小。,MSD与DAD的比较,五、 HPLC-MS的灵敏度,氨基甲酸盐,六、LC-MS联用仪的真空,电喷雾是一种“软”电离技术，通常只形成准分子离子，提供分子量信息。
10、但是在实际工作中，特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而且更需要尽可能多的化合物碎片信息。 碰撞诱导解离（CID）可解决这一不足。,这里所讲的CID是指“源内CID，In-Source CID”。,七、 碰撞诱导解离（CID）技术,惰性气体,没有商业谱库,缩氨酸,（Tandem Mass Spectrometry）,由两个以上的质量分析器串联而成。 简称串联质谱。常见的为：三级四极杆质谱,1. 空间上的串联质谱（tandem-in-space）,八、多极质谱（串联质谱）,API4000三重四级杆质谱仪示意图,CID,单四极杆与串连四极杆质谱对比,串联质谱基本功能：（各种扫描方式） （1）
11、Q1全扫描 （2）母离子（precursor ion）扫描初始离子扫描 （3）子离子（Product Ion）扫描 （4）中性碎片丢失扫描 （5）多重反应监测（Multiple Reaction Monitoring MRM ）,各种扫描方式的原理解释：,Q1 Full Scan (Start Stop)(Q1全扫描) Q1 always used as single MS analyzer Used primarily for ident. of precursor ion,SIM - Selected Ion Monitoring (选择离子监测),Used to optimize ana
12、lyzer for specific ions SIM used for quantitative analyses Q1 SIM used to “optimize” precursor ion Maximize signal in preparation for MS/MS,选择离子监测：SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用于定量。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.,Precursor Ion Scan(母离子扫描),Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixed Us
13、ed to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cell Frequently used for drug metabolite identification (common product ion observed in the metabolites),Example of Precursor Ion Spectrum,母离子扫描的作用,母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中
14、十分重要。,Product Ion Scan(子离子扫描),After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID Q1 is fixed, Q3 sweeps a given mass range Used for structural elucidation（结构确认） First step to developing quantitative method,Example of Product Ion Spectrum,Ephedrine（麻黄碱）, MW
15、= 165,M+1,中性丢失扫描,中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，也可以帮助进行未知物结构判断。例如：18-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。,Multiple Reaction Monitoring (MRM) 多重反应监测,Many precursor to product ion pairs can be monitored (A-B, A-B, etc.) MRM is the best way to maximize signal intensity of product ions MRM used primarily for
16、quantitation,MRM for Quantitation ?,Increased Sensitivity & Specificity,串联质谱可将复杂质谱简化。,灵敏度、针对性、选择性更强,三级四极杆质谱外观图,2. 时间上的串联质谱（tandem-in-time）,只有一个质量分析器，离子阱或傅立叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱可实现这种串联技术。,离子阱工作原理,离子阱技术,工作原理：上下端罩(End cap)与左右环电极(Ring electrode)构成可变电场(前者接地，后者施以射频电压)带电离子会发生振动并与氦气碰撞键断裂改变射频电压可得到不同的碎片离子相同m/z离子依次离开并进入电子倍增器而分离。,特点：结构简单、易于操作。特别适合与色谱联用。,
