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1、2003 中标申请代码：C03020303：题目：一个新的调控肿瘤血管生成的候选分子Rac1 及其作用机制的研究项目的立项依据项目的立项依据（附主要的参考文献目录附主要的参考文献目录）研究意义：研究意义：血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的基础，肿瘤血管生成是一个非常复杂的过程，受多种分子的调节，尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，诸多血管生成调节因子的上游调控机制并未完全阐明；其次，内皮细胞和肿瘤细胞分别通过自分泌和旁分泌途径来调节血管生成，哪些分子能同时调节并协调这两条途径呢？我们的工作基础和文献研究表明 Rac1 可能正是解决这两方面不足的关键分子
2、。Rac1 属于 Rho GTPases 家族，在肿瘤的发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要作用。一方面，我们的研究表明，在缺氧情况下，多种肿瘤细胞中 Rac1mRNA和活性水平较正常明显增高，4h 达到高峰，可持续至 16 h 后表达水平逐渐降低，且其活性高低与 HIF-1、VEGF、p53 表达水平呈正相关；而应用负显性的 Rac1 可显著减弱 VEGF的表达。由于 VEGF 是参与肿瘤血管生成的一个主要分子，这就提示我们，抑制抑制 Rac1Rac1 可能可能直接抑制肿瘤血管生成直接抑制肿瘤血管生成。另有其它研究也同样表明 Rac1Rac1 参与缺氧情况下参与缺氧情况下 H
3、IF-1HIF-1（缺氧诱导（缺氧诱导因子因子 1 1）的活化，促进）的活化，促进 HIF-1HIF-1 的转录活性和蛋白表达。的转录活性和蛋白表达。HIF-1 是肿瘤生长过程中的一个重要调节因子，活化的 HIF-1 可促进许多与血管生成相关的基因的转录，如VEGF、VEGFR、FGF、TGF、Cox2 和 NOS，从而维持肿瘤细胞能量代谢，促进肿瘤的增殖和转移。另一方面，Rac1Rac1 可调节可调节 ECMECM（细胞外基质）和（细胞外基质）和 VEGFVEGF（血管内皮细胞生长因子）诱导的（血管内皮细胞生长因子）诱导的内皮细胞的趋触和趋化作用，促进内皮细胞的增殖、运动和迁移，是内皮细胞的
4、趋触和趋化作用，促进内皮细胞的增殖、运动和迁移，是 VEGFR(VEGFVEGFR(VEGF 受体受体) )后后信号通路的一个重要中间分子。信号通路的一个重要中间分子。此外，许多药物及分子许多药物及分子，如磷酸鞘氨醇、组织因子、非甾体类抗炎药、斯伐他仃和活性氧簇等都通过都通过 Rac1Rac1 调节内皮细胞运动调节内皮细胞运动。因此，Rac1Rac1 可能是可能是血管生成过程中的一个关键调控因子血管生成过程中的一个关键调控因子。为证明这一设想，本研究拟利用 RNAi 和蛋白质双向电泳技术探讨 Rac1 对肿瘤血管生成的调控作用及可能的调控机制，为进一步阐明 Rac1 的生理病理作用、深入理解肿
5、瘤血管生成的机制及开发新型的血管生成抑制剂奠定一定的理论基础。国内外研究现状及分析国内外研究现状及分析1 1血管生成是肿瘤生长、侵袭转移和复发的基础血管生成是肿瘤生长、侵袭转移和复发的基础肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件1。原位肿瘤细胞在肿瘤发生的初期通过组织间液获取从毛细血管渗透的营养物质，排泄代谢产物，并进行氧气交换。由于细胞增殖缓慢且数目有限，局部组织间液足以支持肿瘤细胞的生长，这种状态可维持相当长的时间，称为血管前期。在无自身血供的条件下，肿瘤的体积几乎不超过 12mm3。随着肿瘤细胞的不断增殖，仅通过渗透过程已不能满足细胞生长的需要，瘤体组织的微环境出现缺氧、代谢产物堆积、PH
6、值改变等。这些因素刺激肿瘤细胞、周围的间质细胞和淋巴细胞分泌血管生长刺激因子，同时抑制血管生长抑制因子产生，打破二者在肿瘤组织局部的平衡，诱导血管基底膜降解和内皮细胞增殖，启动血管生成2。肿瘤血管内皮细胞的分裂速度比正常血管内皮细胞快得多，所生成的血管生长因子也可通过自分泌和旁分泌形式参与血管生成的调节。肿瘤侵袭转移在两个阶段依赖血管生成：第一，在原发肿瘤出现新生血管之前，肿瘤细胞一般不会从原发灶脱落，而原发肿瘤的血管组织越丰富，肿瘤细胞转移的机会就越大。新生的肿瘤血管基底膜和细胞连接较少，血管通透性高，是肿瘤细胞转移的门户和路径。第二，转移的瘤细胞在到达目的器官后必须重新经历新血管生成过程，
7、否则转移的细胞只能在它们渗出循环的微血管周围形成显微水平的血管前期袖状结构3-4。肿瘤血管生成还与肿瘤的预后密切相关，通过组织形态学、免疫组化、生物化学和影像学等测定肿瘤组织的血管密度和血管生长因子水平及血清中血管生长因子水平可知，血管生成是多种肿瘤复发、转移和预后的判断标准5，例如浸润性乳腺管癌、早期胃癌、肺腺癌等。2 2肿瘤血管生成是诸多因素共同作用的结果肿瘤血管生成是诸多因素共同作用的结果血管生成是多因素作用的结果，其中血管生长刺激因子和血管生长抑制因子直接地影响血管内皮细胞和基质细胞，二者之间的平衡决定了促进或阻止血管生成。微环境的供血不足会造成局部组织缺氧，从而诱导血管内皮细胞、基质
8、细胞、肿瘤细胞生成血管生长刺激因子和抑制因子，通过自分泌或旁分泌的形式发挥作用，并且某些因子还可进入血液循环，作用于远端组织。血管生长刺激因子不仅能够刺激血管内皮细胞增殖、迁移、基质蛋白裂解和形成毛细血管结构，而且也可作用于血管周围基质细胞和血管壁的平滑肌细胞，诱导其增殖和分泌等。目前已确定出十几种血管生长刺激因子，包括 VEGF 家族、EGF/TGF-、FGF 家族、TNF-、IL-8、血管生成素 angiogenin 等。在正常生理条件下，血管生长抑制因子可维持血管内皮细胞的相对静止状态，防止血管过度增生，与血管生长刺激因子一起构成复杂而精确的调节网络。血管生长抑制因子参与血管生成的各个步
9、骤，既可直接抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，阻碍胞外基质降解，也可通过抑制刺激因子的表达，拮抗其功能，间接抑制血管生成。如肿瘤细胞、肿瘤浸润细胞（单核细胞、巨噬细胞） 、肿瘤血管内皮细胞和基质细胞等分泌的血管生长因子通过自分泌或旁分泌等途径发挥作用。激活的单核细胞/巨噬细胞分泌 TNF- 和 IL-1，刺激黑色素瘤细胞分泌 IL-8 和 VEGF，都可促进肿瘤血管生成。表表 1 血管生长调节因子血管生长调节因子 除了血管生长因子及抑制因子外，肿瘤除了血管生长因子及抑制因子外，肿瘤血管生成血管生成还受癌基因、化合物、激素和酶等多种因还受癌基因、化合物、激素和酶等多种因素的影响。素的影响。肿瘤相关基
10、因表达异常能够导致旁分泌的血管生长因子水平改变，如 ras突变可明显诱导 VEGF 的表达；在慢性胰腺炎和胰腺癌中，K-ras 基因突变与血管生成的增加密切相关，可能促进肿瘤血管生成6。癌基因 c-met 参与多种肿瘤的发生和发展，与肿瘤的预后密切相关，其基因产物是血管刺激因子 HGF 的受体，作为一种跨膜酪氨酸激酶，参与肿瘤血管生长调节7。肿瘤细胞中 p53 突变或缺失则导致 HIF-1增加和 VEGF 转录增强，间接刺激肿瘤血管生成8。此外，多种化合物和激素，如TNP-470 烟曲霉素类似物、NAC、一些类固醇类激素可抑制血管内皮细胞的运动和血管生成；而金属蛋白酶（MMPs）还可通过降解基
11、质促进肿瘤的血管生成和细胞转移。3 3 目前在肿瘤血管生成研究方面存在的不足之处目前在肿瘤血管生成研究方面存在的不足之处尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，目前一些针对上述单个因子或多个因子的治疗并未取得较佳的疗效，是什么原因呢？我们知道，肿瘤的发生是一个多基因参与的复杂过程，与正常细胞相比，肿瘤细胞的表达谱紊乱，表现为多种分子表达失调。同样，在肿瘤的血管生成过程中，单分子的作用是非常微血管生长刺激因子血管生长抑制因子VEGFEndostatinbFGF aFGFAngostatinTGF- EGFIL-1G-CSFIL-12HGFIP-10IL-8SDF
12、-1Platelet-activating factorTSP-1PLGFIFN,ProliferinTIMPs 1,2,3,4PDEGF/Thymidine porylasePF4B6116K prolactin fragmentE-selectinProliferin related proteinAngiogeninProfactin fragmentAngiotropinProtamineAngiopoetinTGFTNFTNFTGFTGFThrombospondinSubstance PMinocyclineProstaglandin E1/E22-methoxycestrandol
13、FAS ligandPetinoic acid弱的，只有多种分子共同作用才能最终导致血管生成。那么，这诸多分子的上游机制是什那么，这诸多分子的上游机制是什么？有没有一个能调控多种肿瘤血管生成相关因素的分子？么？有没有一个能调控多种肿瘤血管生成相关因素的分子？如果能找到一个能有效调节并协调多种因素的分子，也许将为肿瘤血管生成的相关研究开辟新的领域。其次，目前有关肿瘤血管生成方面的研究或者针对肿瘤细胞，或者针对内皮细胞，而未将两者有机地结合起来。肿瘤细胞和内皮细胞可通过旁分泌和自分泌两条途径共同促进肿瘤血管生成，有无关键性的分子可同时调节这两条途径呢？有无关键性的分子可同时调节这两条途径呢？这些问
14、题都有待进一步的研究来解答。目前的文献和我们的工作基础表明 Rac1 可能正是解决这两方面不足的关键分子。4 4 Rac1Rac1 可能是调控肿瘤血管生成的核心分子可能是调控肿瘤血管生成的核心分子4 41 1 Rac1Rac1 与肿瘤与肿瘤Rac1 全称为 Ras 相关的 C3 肉毒毒素底物 1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1） ，属于 Rho-GTP 酶家族。 Rho-GTP 酶是小 GTPases 家族的成员之一，是一组分子质量约 2025kDa 的单体鸟苷酸结合蛋白，其活性受 GDP/GTP 循环调节。Rho 蛋白与GDP 结合时处于
15、非活性状态，在鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）或 GDP 解离刺激因子（GDP dissociation stimulator，GDS）作用下释放GDP，遂结合 GTP 成为活性蛋白。活化的 Rho 蛋白作用于胞浆中多种信号分子，调节细胞内信号的传递。同时，Rho 蛋白的 GTP 酶活性可以将 GTP 转变为 GDP，继使 Rho 蛋白灭活。GTP 酶激活蛋白（GAP）可以诱导 Rho 蛋白的 GTP 酶活性，促进 Rho 蛋白的灭活。另外 GDP解离抑制剂（GDP dissociation inhibitor，GDI）可将胞浆内 GDP 结合形式的 Rho 蛋白从GTP-GDP 循环中分离出来，从而抑制 Rho 蛋白的活性。 Rac1 基因全长 29kb，定位于 7p22，与人类 Rho 及 Ras 基因具有 58%及 30%的氨基酸同源性。Rac1 位于细胞膜内，广泛表达于多种组织，尤以心脏、肾脏及胰腺表达水平高，是一典型的看家基因9。目前的研究表明，目前的研究表明，Rac1Rac1 在肿瘤发生、侵袭和转移、细胞周期调控及在肿瘤发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要的作用。凋亡过程中发挥着重要的作用。Rac1 参与 Ras
