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1、从热不稳定到光不稳定,光修复酶性质及其与隐色素分子进化关系,答辩人 徐蕾 导师 朱国萍 教授,背景介绍,中波紫外线（UVB, 280-315 nm）和短波紫外线（UVC, 200-280 nm）可导致DNA上出现损伤,图1 UV诱导的DNA光产物 Fig. 1 UV-induced DNA photoproducts.,光修复酶可利用光能修复DNA上的紫外损伤,图2 光修复酶修复DNA紫外损伤的机制 Fig. 2 The mechanism of repairing UV-induced lesions in DNA by photolyases. A. CPD photolyase. B.
2、6-4 photolyase.,植物隐（花）色素作为蓝光受体调控植物的生长发育和光形态建成,图3 植物隐色素的信号转导 Fig. 3 Signal transduction of plant cryptochromes,果蝇隐色素作为光受体参与校准生物钟,图4 果蝇隐色素的作用模型 Fig. 4 The model for Drosophila CRYs.,哺乳动物隐色素作为核心组件参与生物钟的调控,图5 哺乳动物隐色素的作用模型 Fig. 5 The model for mammalian CRYs.,一些光修复酶同时具有类似于隐色素的基因表达调控功能,真菌Aspergillus nidul
3、ans中的CryA蛋白，属于CPD光修复酶，具有很强的修复CPD损伤的能力，但对真菌的发育也有调控作用。 植物病原体Cercospora zeae-maydis中一种6-4光修复酶的同源物PHL1，可调控发育以及紫外光诱导的基因表达。 藻类Phaeodactylum tricornutum和Ostreococcus tauri中的6-4光修复酶参与基因表达和生物节律的调控。 红细菌Rhodobacter sphaeroides中的一种FeS-BCP蛋白CryB，既对光修复有贡献，也参与光合作用基因的表达调控。,光修复酶和隐色素尽管功能各异，但其序列同源性较高，结构类似，并且可能都通过相似的光反
4、应机制发挥作用。可统称为隐色素/光修复酶家族 （cryptochrome/photolyase family, CPF）。,CPF家族的分类,图6 CPF家族的分类 Fig. 6 The categories of the cryptochrome/photolyase family (CPF).,重复进化,含铁硫中心,研究思路,研究结果和结论,E. coli光修复酶的热不稳定性CPF蛋白家族的系统发生分析E. coli光修复酶A377位突变对其光照稳定性的影响,E. coli光修复酶的热不稳定性,光修复酶催化底物修复的反应符合米曼氏 （Michaelis-Menten）动力学,催化速率常数k
5、3取决于所接受光强I和光反应常数kpE和S的结合受到温度、酸碱度以及离子强度的影响,光修复,温度酸碱度离子强度,培养温度生长状态,？,培养温度对E. coli胞内光修复酶活性的影响,图7 在不同培养温度下E. coli AB2463菌株稳定期细胞的胞内光修复动力学曲线 Fig. 7 The photoreactivation kinetics of E. coli AB2463 (recA13) stationary cells cultured at various temperatures. The survival was plotted vs. the illuminating tim
6、e.,胞内光修复酶数目25C 224 5237C 99 1142C 11 6,培养温度对E. coli胞内光修复酶活性的影响,胞内光修复酶数目25C 250 2337C 126 1142C 21 9,图8 E. coli AB2480菌株稳定期细胞的闪光修复实验 Fig. 8 Flash repair experiments of E. coli AB2480 stationary cells. The cells were cultured at 25C (A), 37C (B) and 42C (C).,不同培养温度下胞内光修复酶的蛋白水平,图9 不同温度培养的E. coli稳定期细胞中光
7、修复酶的Western blotting检测 Fig. 9 Western blotting analyses of the photolyase levels in E. coli AB2463 (recA13), AB1157 (“wild type”) and AB2480 (recA13, uvrA6) cells cultured at different temperatures. Full-length photolyase is indicated by “PL”.,不同培养温度下phr基因的稳态转录水平,图10 E. coli AB2463细胞中光修复酶基因phr的实时定量R
8、T-PCR检测 Fig. 10 Real-time quantitative RT-PCR analyses with total RNA isolated from E. coli AB2463 (recA13) cells cultured at various temperatures and cell densities.,培养温度对phr启动子控制的lacZ报告基因表达的影响,图11 E. coli phr基因的转录单位 Fig. 11 The transcription unit of E. coli phr gene. It contains ybgA, phr and two
9、promotors P1 and P2.,培养温度对phr启动子控制的lacZ报告基因表达的影响,图12 pLLac和pSLac质粒的图谱 Fig. 12 The maps of plasmids pLLac and pSLac.,培养温度对phr启动子控制的lacZ报告基因表达的影响,图13 受phr基因启动子调控的lacZ报告基因表达的半乳糖苷酶活性测定 Fig. 13 The -galactosidase activity of E. coli DH5 cells (argF-lac)169, 80dlacZ58(M15), recA1 with (A) plasmid pLLac, c
10、ontaining a transcriptional phr-lacZ fusion; or with (B) plasmid pSLac, expressing a photolyase N-terminal / domain-LacZ fusion protein under control of the phr promoters.,E. coli光修复酶在体外的蛋白酶降解性质,re: reduced photolyase apo: apo-photolyaseT: trypsin C: chymotrypsin K: proteinase K,图14 E. coli光修复酶的蛋白酶降
11、解性质 Fig. 14 The proteolytic susceptibility of E. coli photolyase. The bands produced by trypsin and chymotrypsin are indicated by numbers and letters, respectively. The control lane of full-length photolyase is indicated by “PL”.,E. coli光修复酶在体外的蛋白酶降解性质,图15 E. coli光修复酶的胰蛋白酶降解位点 Fig. 15 The possible c
12、leavage sites of trypsin are shown in the crystal structure of E. coli photolyase (1DNP) in stick representations,棕色：re和apo型均能切开 粉色：apo型能切开 黄色：re型能切开绿色：FAD辅酶,体外E. coli光修复酶的热稳定性,使用在不同温度下保温的E. coli光修复酶修复紫外损伤底物，活性测定表明：25C保温10min，活性可保留80%； 37C保温1min，活性下降到30%； 42C保温1min，活性下降到5%以下。,体外E. coli光修复酶的热稳定性,图16
13、E. coli光修复酶各种型式的差示扫描量热的热分析图 Fig. 16 Differential scanning calorimetric thermograms of E. coli photolyase in different forms.,re: reduced photolyase apo: apo-photolyase ox: oxidized photolyase,培养温度转换实验,图17 E. coli AB2463菌株细胞的培养温度转换实验 Fig. 17 Temperature-shift experiments of E. coli AB2463 (recA13) ce
14、lls. (A) The photolyase activity (shown in k1E). (B) The photolyase levels in the cells after temperature-shift were analyzed by Western blotting.,培养温度转换实验,将25C培养的稳定期细胞转移到42C后，细胞内光修复酶在继续培养过程中活性下降非常缓慢。光修复酶的蛋白水平下降比活性的下降更加缓慢。,暗示在胞内可能有一些因素对活性光修复酶（即E-FADH-型）具有保护作用，使其对热变性和蛋白酶具有耐受能力。,培养温度转换实验,在42C培养的稳定期细胞中
15、，光修复酶活性和蛋白水平都较低。,可能由于在细胞生长过程中，新合成的光修复酶脱辅酶蛋白在结合FAD辅酶之前就发生热变性，然后被蛋白酶降解。,培养温度转换实验,图17 E. coli AB2463菌株细胞的培养温度转换实验 Fig. 17 Temperature-shift experiments of E. coli AB2463 (recA13) cells. (A) The photolyase activity (shown in k1E). (B) The photolyase levels in the cells after temperature-shift were analy
16、zed by Western blotting.,培养温度转换实验,将42C培养的稳定期细胞转移至25C继续培养，其胞内光修复酶活性和蛋白水平几乎没有上升。,可能由于phr基因转录的mRNA在翻译数轮后会被关闭，即使当之前翻译的光修复酶变性降解后，翻译也不会再开放。,mRNA,YbgA,X,小结,在培养温度 37C时，E. coli胞内光修复酶活性会显著下降。,胞内光修复酶蛋白水平在较高培养温度时下降，但光修复酶基因的转录水平并不受培养温度的影响。,光修复酶在较高培养温度时蛋白水平的变化可能是由于新合成的、未结合辅酶的光修复酶蛋白受热变性，并被蛋白酶降解导致的。,光修复酶的热不稳定性可能作为“原型”，进化出一些隐色素所具有的光不稳定性。,CPF蛋白家族的系统发生分析,选择3个已解出结构的CPF家族蛋白的序列：Escherichia coli CPD I光修复酶 （1DNP_A） Methanosarcina mazei CPD II光修复酶 （2XRZ_A） Agrobacterium fabrum FeS-BCP蛋白 （4DJA_A）分别作为查询序列，通过TBLASTN功能对全基因组和转录组数据库进行搜索，获取序列。,
