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1、第二军医大学药物安全性评价中心 陆国才,新药临床前毒理学评价 Preclinical Toxicological Evaluation of New Drug,Contents,目的意义 急性毒性试验(acute) 长期毒性试验(chronic) 特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌) 其它毒性试验(过敏、刺激 etc.) 药物非临床研究质量管理规范（GLP） SFDA新药审评会 案例学习,Acute Toxicity Test,概念、目的意义 传统方法基本内容和要求 有关问题 其它实验方法,Concept,动物单次或24h内多次给予受试物后，一定时间内(14天)所产生的毒性反应 毒理研究早期阶段进
2、行,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dose 安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 确保临床用药安全(重点监测指标),目的意义,阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数 了解毒性靶器官 为长毒、特殊毒性试验剂量设计 为期临床试验起始剂量选择 为临床毒副反应监护提供参考 其它(DO STAR),OECD口服急性毒性分级
3、,相对毒性参数,治疗指数TI =LD50/ED50 安全系数SF=LD5/ED95 可靠或确实安全系数CSF =LD1/ED99 安全范围SM=(LD1/ED99-1) X 100% SED50/ED50, 越大越安全 LD5基本无害量 ED95基本有效量 LD1肯定无害量 ED99肯定有效量,为临床毒副反 应监护提供参考,中毒症状,起始、持续、恢复时间 中毒靶器官 对抗试验为临床急救提供依据,为长毒等试验选 择剂量提供依据,长期毒性剂量设计 LD50法 (1/10, 1/50, 1/100) MTD法 ( 1, 1/3, 1/10) 生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD 主要药效学剂量限度、一般药
4、理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50,为特殊毒性试验 选择剂量提供依据,致突变试验 啮齿类动物微核试验高剂量为1/2 LD50 果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD50和1/4 LD50 精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2 LD50 短期致癌试验高剂量=MTD,I 期临床选择起 始剂量提供参考,细胞毒类抗癌药，I期临床起始剂量= 1/10 LD50,其 它,系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50 复方药物的相互作用, 也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质 比较不同途径的LD50，获得一些生物利用度信息，为剂型开发提供参考,基本原则,执行GL
5、P 整体性 具体问题具体分析 阶段性 随机、对照、重复 方法公认,动 物,获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物 啮齿类-小鼠或大鼠 非啮齿类-犬或猴 二种动物(啮齿类及非啮齿类) 小鼠18-22g; 大鼠120-150g; 犬用成年犬 初始体重不应超过或低于平均体重的20% 各半 (勤俭办事，服从命令),受 试 物,工艺稳定、符合临床用质量标准 标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告 辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求,受 试 物,原料药 临床拟用剂型 复方制剂：复方 + 拆方 (增毒？新毒？) 易降解：含降解产物量最高的受试物进行急毒试
6、验，并与临床样品的急毒试验结果比较,给药途径,临床拟用途径 + 原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射） 啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水,剂量和分组,给药剂量：未见毒性量严重毒性量 设空白和/或溶媒（辅料）对照 小动物4-6个剂量组, 组距0.65-0.85,求LD50 大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法), 求出ALD和MTD，不必达到致死量,给药容积,不等浓度等容量给药 常规及最大给药容量为:,观察指标及时间,药后4h内详观, 后每天上下午各一,观察14d 记录毒性反应、死亡情况, 中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间 其它指标：一般指标、体
7、重变化等,急性毒性研究的一般观察和指征,病理学检查,大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物) 组织病理学检查: 体积、颜色、质地等改变时,结果处理,实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD50表. XXX急性毒性结果及LD50计算剂 量 对数剂量 动物数 死亡动物数 死亡率 机率单位 LD50及可信限 (mg/kg) (X) (只) (只) % (Y) (mg/kg),结果处理,剂量反应、时间反应关系 反应可能涉及组织、器官或系统 肉眼病变和组织病检，初步判断毒性靶器官 病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片,确定NOAEL、 MTD、ALD etc，初步判断受试物的安全
8、范围,综合评价,判断反应与药物作用相关性： 时间、发生率、剂量-反应关系 动物种属及背景数据 病理学检查结果 同类药物特点 安全范围、毒性严重程度及可恢复性 毒性作用靶器官 毒性可能涉及部位 大体解剖和组织病理学检查结果,注意问题,光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验 照光 + 不照光分别测定LD50 复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价,注意问题,充分重视预试 毒理学界对LD50看法 试验结果（信息）的一部分 LD50测定不足： 动物消耗量大 获得信息有限 测得数值不准,EPA Policies,Discourages the use of the Classical LD50 test Us
9、es Structurally Related Activities (SRA) to obviate the need for testing on animals Recommends the Limit test,EPA Policies,Beyond the Limit, recommends approximate lethal dose the up-and-down methods,近似致死剂量法(非啮齿类动物),6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出剂量序列表,First,最低致死剂量,最高非致死剂量,
10、最低致死剂量,最高非致死剂量,OR,近似致死 剂量范围,近似致死 剂量范围,Second,MTD法,最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50, 可只求MTD值 一次或24h多次(总量5g/kg)给20只动物 观察14d, 未见死亡, 则MTD XX g/kg;个别死亡, 则写成LD50 XX g/kg iv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20s ig时空腹, 即禁食12-16h左右,常用容量和最大容量(ml), 最大无毒性反应剂量（no observed adverse effect level, NOAEL) ：指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观
11、察指标未发现损害作用的最高剂量 最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量 最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量 最小致死剂量（minimal lethal dose，MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量 半数致死量（median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。,长 期 毒 性 试 验 Long-term Toxicity Study,目的意义 基本内容和要求 有关问题 Mechanic? Innovative ?,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dose
12、安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 确保临床用药安全(重点监测指标),基本原则,执行GLP 整体性 具体问题具体分析 阶段性 随机、对照、重复 方法公认,Procedure,Animals Housing Drug Route Dosage Group Duration Index Recovery Time Report（动饲药径
13、剂组 周指恢时报告）,Animal,in vitro体系筛选实验动物种属或品系 理想动物 对受试物生物转化与人体相近 对受试物敏感 已有大量历史对照数据,Animals,rodent non-rodentrat beagle dogmouse monkey,Animal,二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬, 必要时用猴、猪等 符合等级要求 来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证 大鼠6-9 w， Beagle犬6-12 m,体重CV20 各半 必要时，可用疾病模型动物进行试验 Duration 6m, natural death ( rat: 1y-15%, 1.5y-50
14、%, 2y-70-80%) (勤俭办事，服从命令）,XXX 体外代谢种属比较研究,结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评,动物选择,XXXX西地那非,已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4） PDE5抑制剂，治疗男性ED 选用雄性动物进行下列试验 急性毒性（大鼠、小鼠） 安全药理学（小鼠、犬） 须与已上市药物进行对比 （已上市药需国外进口或买不到时？）,动物选择,治疗HER2阳性乳腺癌药物,治疗妇女HER2阳性乳腺癌 用雌性动物进行一般毒理学研究 厂家要求选用雌雄各半动物，何故？,动物选择,Housing,T, humidity, light, ventilation, animal feeds
15、 Rat: 5 /cage or separated，acclimation 1w Dog: TB test, anthelmintic acclimation: 1-2w / 1m,饲养管理,Drug,test article / solvent / excipientname, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion,Route,与临床用药途径一致 临床iv , 大鼠给药1月，ip代替 im或sc应变换注射部位 必要时改变给药途径但应说明原因,模拟临床给药途径,纤维蛋白胶：犬腹腔给药 小儿止泻贴剂：相当于脐部给药,途径方式,Dose and Group,三个给药组, 单位：mg (IU)/kg 或 mg (IU)/m2 不等浓度等容量给药 低剂量组高于有效剂量，不出现毒性 中剂量组轻微或中等度毒性 高剂量组明显/严重毒性，或个别动物死亡 空白对照溶媒或赋形剂 溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组 阳性对照,Dose and Group,大鼠各15只/组 大动物各5只/组,特例：等浓度不等容量给药,
