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1、基因克隆原理及实验介绍,The principle and experiment of gene cloning,中药教研室,内容概要,实验进展汇报（5.108.24）基因克隆基本原理及实验操作,分子生物学,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子，其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传递中的作用和作用规律。,基因克隆,基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切
2、、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。,pcDNA3.1+3flag,pCR,双酶切,连接,引物设计,回收纯化,重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3,pCR,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,大肠杆菌(感受态),引物设计,回收纯化,载体,目的片段,酶切鉴定,实验流程,引物设计,从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）复
3、制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位点,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,ori 是复制起点,他被宿主细胞识别后才能在该细胞中复制。,Primer Premier 5,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,Primer Premier 5,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,引物处理 Procedure,标记，Sense F，Antise R ，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1
4、”离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100M）的10倍量稀释至使用浓度10M保存，分装-20,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,Attention,离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏M 是浓度单位，如100M=100mol/L引物稀释量向上取5倍整数，如383l稀释至385l,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,引物设计,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,回收纯化,pCR,A,B,*延伸时间计算： ，向上取整数（多预留延伸时间）,*
5、 退火温度计算：一般为上下游引物TM平均值5,Attention,试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。注意不同引物对应不同PCR管PCR 结果优化略，详见pCR常见问题解决方法,引物设计,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,pCR,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。 原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时根据分子大小不同形成不同的
6、条带 根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶,引物设计,pCR,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,回收纯化,引物设计,pCR,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,回收纯化,Attention,琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔），或插入孔径不同的梳子EB具有强致癌性，应在污染区操作为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往左点（靠近自己一段开始）Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA样品的大小。红色为正极，黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负)。,引物设计,pCR,双酶切,连接,
7、转化,挑菌,提质粒,测序,回收纯化,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1,引物设计,pCR,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,回收纯化,Procedure,打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：,Objective,原理：限制性内
8、切酶能特异地结合于一段特定的DNA序列的特异位点上,并切割双链DNA 目的DNA与质粒载体同时进行双酶切（两个不同的酶切位点，如BamH1和EcoR1），形成同样的酶切位点为进行连接,引物设计,pCR,回收纯化,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,双酶切,Procedure,目的DNA酶切体系,载体酶切体系,*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/l，4000bp，反应体积约为9l）,混匀，37孵育4-6h（6h以上更佳）,Objective,通过凝胶电泳验证目的DNA、质粒是否酶切成功，并通过胶回收DNA及质粒（切去的片段除外）最终回收体积为30l 通过连接使目的DNA导
9、入质粒中，为下一步转染准备,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,转化,挑菌,提质粒,测序,连接,Procedure,目的DNA与质粒连接体系,混匀，4过夜或常温条件下反应4h,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,挑菌,提质粒,测序,转化,Objective,将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠杆菌中大量复制,LB培养基配制,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,提质粒,测序,挑菌,Objective,从大肠杆菌培养基中挑取优势菌落（单菌落）进行扩大培养 培养过夜后取出部分菌液进行保菌,Procedure,消毒实验台及器具，取酒精棉球擦拭桌面
10、、镊子，准备无菌枪头、试管、试管板两个，点燃酒精灯，酒精消毒双手 取LB培养液加入抗生素，向各试管中倒入LB培养液约10-15ml 从培养箱中取出培养皿，在火源附近打开，用镊子夹取一个枪头，挑取一个单菌落，轻轻沾取菌落，枪头丢入试管内，每菌种挑取2-3管 培养皿用封口膜封好放入4保存 将试管放入摇床震荡培养过夜，次日出现浑浊 消毒桌面，取1.5ml无菌Ep管标记 摇匀试管，使底部菌落分散，吸取1000l菌液，加入200l 60%甘油， -20装袋保存,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,提质粒,测序,挑菌,Objective,从宿主细胞大肠杆菌中提取大量复制后的质粒,引物设计,pC
11、R,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,测序,提质粒,Procedure,按照E.Z.N.ATM Endo-free Plasmid Mini Kit (200)试剂盒说明书提取质粒,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,测序,质粒浓度检测器,260/280比值（约1.8）260/230比值（约2.1）浓度400（ng/l）,提质粒,Objective,双酶切方法使鉴定重组质粒是否成功连接，凝胶电泳下观察条带（质粒、目的DNA）,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,Procedure,酶切验证体系,混匀，4过夜或常温条件下反应4h37水浴反应1-
12、2h获得的酶切产物加入2l Loading Buffer ，取10l进行琼脂糖凝胶电泳（小孔）,Attention,填写送样登记表，样品资料（样品名称、类型、抗性、载体名称、长度）用PCR管按上述样品名称标记，每管取10l送样测序,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,样品应完全解冻再取样测序结果未完成前所有实验过程的中间产物不得丢弃，并做好记录测序引物一般为通用，如结果不佳时才选择自备测序要求一般为测通（单次反应800bp，测通即多次反应直到全部测出为止，结果需要拼接）,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,引物设计,pCR,回收纯化,双酶切,连接,转化,挑菌,提质粒,测序,需要的生物软件,Primer Premier 5 ：引物设计（分析酶切位点、引物数值分析等）DNAMAN 8 ：查看序列，序列比对等Chromas ：查看碱基峰形,Thank you !,
