《3.2 原核生物的转录调控 to upload 2016年春》由会员分享，可在线阅读，更多相关《3.2 原核生物的转录调控 to upload 2016年春（85页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、原核生物的转录调控,转录的两个基本问题：1、蛋白质如何识别DNA的结合位点？2、转录的抑制或增强是如何进行的？,基因表达与转录调控,重要的概念,1、反式作用因子和顺式作用元件,2、结构基因和调控基因,3、正调控和负调控,4、单顺反子和多顺反子,5、异构调控,反式作用因子和顺式作用元件,基因的转录活性主要通过反式作用因子（trans-acting factor）和顺式作用元件（cis-acting element）之间的特异相互作用来调节。 反式作用因子为蛋白质。例如：RNA聚合酶 顺式作用元件为DNA 。例如 ：启动子和终止子,反式作用和顺式作用的概念,反式作用,顺式作用,结构基因和调控基因,
2、结构基因（structural gene）：编码RNA或蛋白质（包括结构蛋白、酶和调控蛋白）的基因；调控基因（regulator gene）: 编码调控蛋白（regulator protein）的基因，参与调控一个或多个结构基因表达。调控蛋白通过结合在DNA的特定位点以调控其转录。,靶基因位点,调控蛋白,激活蛋白（activator）：增强转录,阻遏蛋白（repressor） ：抑制转录,9,调控蛋白缺失: 基底转录,负调控（negative regulation）：阻遏蛋白结合DNA 抑制基因表达,正调控（positive regulation）：激活蛋白结合DNA 增强基因表达,正调控和负
3、调控,单顺反子（monocistonic message）和多顺反子（polycistonic message）,异构调控 （allostery regulation),许多调控蛋白都是变构蛋白(allosteric protein)，通过与效应物结合改变构象而改变活性，起到调节基因转录表达的作用，即异构调控,细菌基因表达调控策略：将功能相关的基因集合成组，这样易于整体调控。&相互临近、协同调控的一组基因的被称为操纵子（operon）。如：lac操纵子&非临近但协同调控的一组基因的被称为调节子如：mal调节子,操纵子与乳糖操纵子,1.提出：1961年, Jacob （雅格布）-Monod（莫诺
4、）.2.操纵子(operon)：操纵子是原核生物基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：结构基因、调控元件和调节基因。 大肠杆菌K12中共有4136个基因，以操纵子结构存在的基因接近1/4 （256 操纵子，控制879基因）,操纵子结构,结构基因：控制某一代谢途径关键酶的多顺反子。调控元件：启动子和操纵区（覆盖在启动子和编码区交叉区，是阻遏调节蛋白质的结合位点）。调节基因：独立编码蛋白质的基因。 调节基因的产物结合调控元件，抑制或激活结构基因的表达。,乳糖操纵子,The lacZ, lacY, lacA genes are transcribed into a single lacZYA mR
5、NA (多顺反子) under the control of a single promoter Plac .,操纵基因，又称操作子(operator)，为顺式调控元件，不编码任何产物！,细菌生长特点,环境变化营养供给能量消耗最低化 当某种物质不存在时，细菌就不合成该物质代谢途径中的酶；而当该物质出现时，立即合成所需的代谢酶。这种当特定底物出现才合成特定酶的过程称为诱导（induction）。,细菌能够快速做出应答，迅速从利用一种物质转变为另一种物质,双峰生长(diauxic growth),E. coli 生长在含有葡萄糖（glucose）和乳糖（lactose）的培养基上。细胞首先利用葡萄
6、糖快速生长，直至葡萄糖耗尽。随后，细胞停止生长，“调整”以适应新的营养源乳糖。,在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。,结果解读,细菌开始乳糖代谢所需要的酶,1、将乳糖转运至细胞内,-半乳糖通透酶,2、乳糖代谢：分解乳糖（二糖）分解为单糖,b-半乳糖苷酶,3、 -半乳糖苷乙酰转移酶，作用不明。,在有葡萄糖存在时，细菌体内的这三种酶含量很低。每
7、个细胞中只有35个分子的半乳糖昔酶。当培养基中没有葡萄糖而有乳糖存在时，这三种酶的量急剧增加，23分钟内即可增加1000倍以上，而且三种酶成比例增加。一旦乳糖用完，在23分钟内这三种酶的量又很快下降到本底水平。,启动子,调控元件,结构基因,-半乳糖通透酶,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷乙酰转移酶,调节基因,操纵基因,PlacI,启动子,lacZ,乳糖/半乳糖苷,半乳糖,葡萄糖,b-半乳糖苷键,b-半乳糖苷酶,异乳糖,b-半乳糖苷酶催化侧链反应使乳糖重排，形成异乳糖（诱导物）,lacY,lacA,启动子,调控元件,结构基因,-半乳糖通透酶,分解乳糖,半乳糖和葡萄糖,运送乳糖透过细胞壁,乙酰辅酶A,乙酰
8、半乳糖,-半乳糖苷乙酰转移酶,调节基因,操纵基因,PlacI,启动子,阻遏蛋白lacI（Lac repressor）,1、LacI可以结合DNA，其结合位点为operator（O）; 作用机制： LacI结合O位点，从而抑制RNA聚合酶和LacZYA基因启动子（PLac）的结合，从而阻止LacZYA mRNA的生成；2、LacI可以结合诱导物半乳糖，构象发生改变，不能结合operator, 从而对Lac操纵子的抑制消失。,阻遏蛋白lacI单体具有DNA结合域（Helix-turn-helix，1-59位氨基酸）和诱导物结合域。,阻遏蛋白lacI单体,寡聚化,N末端,C末端,诱导物结合位点,阻遏
9、蛋白lacI四聚体的组装,诱导物结合部位,阻遏蛋白lacI由四个相同的单体亚基组成。,O1,RNA polymerase: a2bb s70,TTGACA,TATAAT,-35box,-10box,s70的一般识别位点,TTTACA,TATGTT,-35box,-10box,Lac操纵子promoter:,A,A,A,down,up,Lac操纵子的O1,回文结构,In Jacob and Monads model, the lac operon contained a single operator (O1).However, two additional operators (O2 and
10、O3) were subsequently discovered.,In fact, there are three operators, the classical operator O1（major operator, 主操纵基因）, centered at position +11, the downstream auxiliary operator（辅助操纵基因） O2, centered at position +412, and upstream auxiliary operator O3, centered at 82.CAP is a positive regulator of
11、 the lac operon.,四聚体LacI蛋白和DNA的结合,1、四聚体LacI蛋白的两个单体通过DNA结合结构域与Lac操纵子的O1区（中心位于+11）紧密结合，结合位点为反向重复序列。 2、另一个二聚体的DNA结合结构域与O2（中心位于+412bp处）或O3（中心位于-82bp处）疏松结合，将DNA拉成环状。,阻遏蛋白lacI与DNA的结合是通过异构调控来调节的,阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化：1、 阻遏物由两个二聚体组成四聚体；2、 二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续转角；3、 诱导物（异乳糖）结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头
12、部不能同时和DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力,诱导物改变LacI在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白：随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上（并不形成游离蛋白质）除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上,阻遏蛋白总是与DNA结合在一起,问题,乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（约为诱导时表达水平的0.1%左右），这是由于LacI与O也偶尔解离，使细胞中有极低水平的-半乳糖苷酶及-半乳糖通透酶生成。,1、抑制
13、子LacI负调控2、葡萄糖抑制Lac操纵子 葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻 3、CAP-cAMP复合物正调控,Lac操纵子的调控因子,异乳糖,诱导物,乳糖,重排,-半乳糖苷酶,透性酶,转乙酰酶,RNA聚合酶,LacI单体,LacI四聚体,lacI介导的lac操纵子基因表达的负调控机制,PEP提供磷酸基团，Enzyme I (E1)直接被PEP磷酸化，磷酸化的E1将它的磷酸基团转移到HPr（磷酸载体蛋白 ），磷酸化的HPr是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基团供体：磷酸基团从HPr转移到EIIAGlc,
14、再到EIIB, 最终到达连接了葡萄糖的EIIC（有时会带上一个额外的链EIID），使葡萄糖发生磷酸化。,EIIAGlc,EIIAGlc,IIAGlc是葡萄糖专一的酶II，具有多种调节的相互作用。它影响腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（如：-半乳糖通透酶）的活性,磷酸转移酶系统（Phosphotransferase System，PTS）：单糖转运系统,葡萄糖抑制Lac操纵子的分子机制,-半乳糖通透酶,葡萄糖对Lac操纵子的分解代谢阻遏(catabolic repression) ：IIAGlc由于葡萄糖转运而去磷酸化，导致其结合-半乳糖通透酶，从而阻止乳糖进入细胞。,Lac操纵子的正调控
15、因子,功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活lac promoter，使RNA聚合酶结合并转录结构基因。lac operon的正调控因子为一个复合体：cAMP结合其受体（cAMP receptor protein, CRP）。CRP又称为“降解代谢物激活蛋白”（catabolite activator protein, CAP）,环化AMP,cAMP-CAP复合物正调控的操纵子：lac, gal, ara等,CAP对cAMP介导的b-半乳糖苷酶的激活至关重要,提取wild-type和mutant的细胞提取物，分别加入不同量的cAMP进行体外生产半乳糖苷酶；过多的cAMP间接抑制了半乳糖苷酶体外表达
16、的某些步骤,转录激活因子CAP,cAMP-CAP与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，形成一个“环状”结构， lacI无法与O相结合，易于形成转录起始复合物，只要有这个“环”的亚基存在，lac operon就可以得到表达。 cAMP-CAP还能直接和RNA Pol相互作用，影响RNA聚合酶的活性。,CAP-cAMP-DNA complex. Science 2002,Cell 1994,CAP,cAMP/CAP的调控活性受AGlc蛋白的影响：AGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶，当葡萄糖进入细胞时AGlc蛋白发生去磷酸化，导致腺苷酸环化酶活性降低。因此，当环境中无葡萄糖时，细胞内cAMP含量升高。,腺苷酸环化酶,有葡萄糖时，cAMP浓度降低，lac操纵子表达下降。由于Plac是弱启动子，只因乳糖的存在而发生去阻遏而使lac操纵子开放表达水平很低；有cAMP-CAP加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。,
