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1、LC-MS/MS临床检验应用进展,上海市徐汇区中心医院 李水军 2013.10.29,报告提纲,液质联用技术原理国内外临床应用进展在我院的应用情况介绍 同型半胱氨酸 25-羟基维生素D 1,5-脱水葡萄糖醇问题和展望,质谱技术发展历史,质谱仪组成,由离子源、真空接口、质量分析器和检测器组成。根据检测器类型可分为磁质谱、四级杆质谱、离子阱质谱、傅里叶回旋共振质谱、飞行时间质谱。,LC-MS/MS仪,灵敏度g/mL,灵敏度ng/mL或者pg/mL,HPLC, $,MS, $,API,High vacuum,LC-MS/MS工作原理,+,Ionization,+,+,+,MS1,+,MS2,Frag
2、mentation,Detection,LC,LC-MS/MS优势,特异性好，免疫分析对小分子化合物的检测缺陷 比HPLC和GC-MS的容易使用，通量更大，是免疫分析法的主要互补方法 与其他技术相比，单个样本的测试成本更低 建立和验证新方法比较容易,国外LC-MS/MS应用,2000年，LC-MS/MS开始应用于药物研发领域，逐步从标准技术成为国际通用技术 2010年， LC-MS/MS广泛应用于欧美临检参考实验室。由于第三方检测机构的推动， 从大型医院临检实验室向中小型、甚至社区医院扩展,Vogeser, Clin Chem Lab Med 2003;41:117-126. Dooley,
3、Clin Biochem 2003;36:471-481. Vogeser, Clin Biochem 2008;41:649-662.,LC-MS在PubMed论文发表数量,临检主要应用领域,新生儿筛查：氨基酸、肉毒碱、脂肪酸、有机酸 药物中毒、滥用药物分析、止痛药物分析 治疗药物监测：免疫抑制剂、抗癫痫药物、抗心律失常药 内分泌分析：肾上腺激素、性激素 蛋白鉴定和定量：C肽、PTH、血管紧张素 功能医学检测 以美国Mayo Clinic为例，1998年没有LC-MS/MS。2010年，60台LC-MS/MS，200万个测试。,Grebe SK, Singh RJ. Clin Biochem
4、 Rev. 2011 Feb;32(1):5-31.,LC-MS/MS国内应用现状,在各大医院已普及，主要用于临床药理 但在临检领域尚处于起步阶段 卫生部临检中心 部分医院检验科 第三方检验机构,质谱法常作为参考方法，用于参考测量程序和校准品定值,我院应用简介,2000年引进LC-MS/MS，主要用于临床药理和临床科研。2002年开始探索临检应用：同型半胱氨酸、TDM、生物标志物（心血管病、糖尿病、前列腺癌）、内分泌（性激素、肾上腺激素）、维生素、氨基酸等。,同型半胱氨酸(Hcy)： 心血管疾病独立危险因子,H型高血压增加心脑血管事件30倍,Relative Risk (Vascular Di
5、sease),流行病学研究证明，“H型”高血压患者心血管事件发生率较单纯存在高血压的患者高出约5倍，较正常人高出约25-30倍。,Graham IM, et al. JAMA. 1997; 277(22):1775-81.,Hcy代谢,Hcy,Met,AdoMet,AdoHcy,THF,CH3THF,CH2THF,CHOTHF,Cys,B6,BHMT,MTR,B12,B2,蛋氨酸循环,叶酸循环,Refsum H, et al. Clin Chem. 2004;50(1):3-32.,血中Hcy形式,Hcy-Albumin,Hcy-Cys,Hcy,80% bHcy,20% fHcy,正常tHcy
6、 5-15 mol/L,Hcy检测方法原理,检测分析流程,临床研究与应用,体检人群血浆/血清Hcy测定结果,住院病人血浆/血清Hcy测定结果,Li S, et al. J Chromatogr B. 2008;870(1):63-67,卫生部临床检验中心 2011年全国同型半胱氨酸EQA,循环酶法和LC-MS/MS法结果差异明显，Bias从10.64%至21.80% 循环酶法的室间差异较大，CV 9.10-12.61%。,合作开发检测试剂盒,国内首个获得SFDA批准，具有自主知识产权的液相色谱串联质谱HCY体外诊断试剂盒 国食药监械（准）字2007第3401206号,与现有方法比较优势,LC-
7、MS/MS技术已成为目前生物样品中小分子化合物定性定量测定的金标准方法高准确性和特异性，直接测定质量, 专一、灵敏、通用高通量：超过400测试/天长期运行成本低：使用通用试剂、消耗品成本低廉，大批量测定有优势,25羟基维生素D(25OHD)： 维生素D营养状况的最佳指标,VITAMIN D,据估计，全球有10亿人维生素D缺乏或者不足。骨质疏松症只是维生素D缺乏的冰山一角，对人体的健康的影响极为广泛。 维生素D 可降低慢性病，包括癌症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病等发病风险。,维生素D缺乏相当普遍,Holick MF. N Engl J Med. 2007;357(3):266-281.,上
8、海的维生素D调查情况,25OHD 16.4 5.3 ng/mL (2.5th-97.5th 7.9-28.8 ng/mL),25OHD检测市场需求巨大,25OHD检测方法比较,LC-MS/MS与ECLIA方法比较,y = 0.514x+1.269 ng/mL, r= 0.590, Sy|x = -11.9 ng/mL (ECLIA for 25OHD3),LC-MS/MS与ECLIA总25OHD比较,y= 1.364x-1.815 ng/mL, r = 0.834, Sy|x = 5.22 ng/mL (ECLIA for 25OHD total),LC-MS/MS与EIA总25OHD比较,y
9、 = 1.120x+ 7.274 ng/mL, r = 0.723, Sy|x = 9.06 ng/mL (EIA for 25OHD total),y = 0.885x+ 1.672 ng/mL, r = 0.987, Sy|x = -1.88 ng/mL (LC-MS/MS for 25OHD2 and 25OHD3),LC-MS/MS与美国CAP比较,LC-MS/MS与NIST的LC-MS/MS参考方法比较,y = 0.9222x-0.045 ng/mL, r = 0.9971, Sy|x = 1.47 ng/mL (LC-MS/MS for 25OHD2 and 25OHD3),方法不
10、同导致完全不同的临床判断,1,5-脱水葡萄糖醇 (1,5-AG),我国糖尿病现状,36,控制糖尿病并发症风险,糖尿病的并发症分为微血管并发症和大血管并发症。糖尿病学分会慢性并发症调查组报告住院2型糖尿病并发症患病率分别为：高血压34.2%，脑血管病12.6%，心血管病17.1%，下肢血管病5.2%。防治心脑血管疾病所需的医疗支出，占糖尿病医疗费用的最主要部分。单纯餐后血糖升高者占近50%。,37,中国2型糖尿病防治指南（2010版）,血糖控制不良人群占63%,Data from NHANES and DCCT,血糖监测指标,1,5AG,果糖胺,10,8,9,7,5,6,4,3,1,2,0,Hb
11、A1C,葡萄糖,Weeks before measurement,1,5-AG使血糖监控更加严密完整和科学！,1,5-AG的生理特征,40,Buse JB et al. Diab Tech & Ther 2003, 5(3): 355-363,高血糖,尿排泄1,5-AG 增加,1,5-AG 重吸收,血1,5-AG下降,1,5-AG可监测到血糖的细微变化,Yamanouchi T et al.Lancet 1996,2型糖尿病人治疗过程中考察1，5-AG的变化 A组28例糖尿病人连续治疗6周 B组28例糖尿病人连续治疗4周后终止治疗,方法验证,临床应用,Li S et al. J Chromat
12、ogr. 2008;875(2):459-64.,1,5-AG与其他指标的相关性,1,5-AG临床意义,1,5-AG与血糖控制关系,美国糖尿病协会指出预防糖尿病病并发症的重要性在于严格的血糖控制。间歇性的血糖波动比慢性高血糖对血管内皮细胞的损伤更大。 1,5-AG测试结果2周内发生变化，医生可以利用检测结果及时了解患者血糖控制的改进效果或恶化程度。 1,5-AG能更准确地反映餐后血糖变化情况，有利于监控糖尿病并发症的风险。,优势和潜力,国际认可、国内尚未普及的临检新指标金标准方法，临床诊断的准确性优势明显高通量检测，连续测试可超过300个/天有效填补临床糖尿病管理的信息数据链缺口 可客观评价病
13、人住院期间的血糖控制情况其临床应用推广及相关科研价值凸显,质谱技术用于临床问题与瓶颈,技术操作政策,技术,方法重现性通量限制 分析时间 样品处理 和信息系统的连接内源性物质、同分异构体、代谢物的干扰基质效应（离子抑制增强） 稳定同位素内标（ID-MS）,Vogeser, Clin Chem Lab Med 2003;41:117-126. Dooley, Clin Biochem 2003;36:471-481. Vogeser, Clin Biochem 2008;41:649-662.,操作,仪器贵，试剂成本低 初始投资大，长期回报高 技术门槛高，有利自主创新 要求批量分析，报告周期长 配套技术及专用试剂盒有待开发,政策,用于临床检验在国内刚起步高新技术临床应用社会认同有待提高缺乏相应的规范性文件和专业组织没有相应的临检收费标准,未来展望,样品前处理、检测通量和配套试剂的创新蛋白和多肽定量高分辨质谱,
