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1、生化检验常见问题及处理方法,黑龙江中医药大学附属第一医院 艾民,生化检验常见的问题,一、检验前常见问题 1、患者的准备问题； 2、标本的采集、运输、验收等问题。 二、检验过程常见问题 1、标本处理问题；2、水质问题；3、交叉污染问题； 4、校准问题； 5、试剂问题；6、仪器问题； 7、参数问题； 8、质控问题 9、干扰物质 三、检验后常见问题 1、检验报告基本信息问题； 2、检验报告签发问题。,一、检验前常见问题及处理,检验前的质量管理是检验质量管理中最薄弱、最易出现问题、最难控制的环节，标本质量不符合要求占60%-80% 。 按时间顺序包括：检验申请患者准备和识别原始样本采集、运送和实验室内
2、传递。,检验前常见问题及处理,1、患者的准备的常见问题及处理: （1）饮食：餐后、饮料、烟酒等，影响患者的检测结果。 处理方法：患者空腹（8-12小时）。 （2）药物等其他因素的影响:如含VC、抗肿瘤药物、 降脂药物、输液等。 处理方法：尽量停止使用药物。超过药物的半衰期。,（3）运动：剧烈的运动可使血中的一些酶类、离子等结果发生变化。 处理方法：检查前一天不要做剧烈运动。短期休息，平稳10分钟以上。 （4）情绪：情绪激动，影响神经内分泌系统，使一些检验结果偏高。 （5）体位：从立位到卧位使一些结果下降。 （6）特定时间采血：因人体生物节律的变化，不同时间采血检验结果也会随着变化。如激素、糖耐
3、量等。,检验前常见问题及处理,2、标本的采集、运输、验收等问题及处理。 （1）标本的采集：止血带压迫时间过长、标本混有气泡、 溶血、污染、输液时采血、标本量不足等。 （2）标本运输：时间过长、过度震荡、污染、高温变质、 冷冻溶血、阳光照射等。 处理方法：及时送检、用标本转运箱，外委标本要求要严格避免上述情况。,（3）标本验收：标本错误、标本外观溶血、脂血、样本留取时间过长等。 处理方法：严格核对标本、拒收严重溶血、脂血、标本不足留取时间过长的标本。,二、检验过程常见问题,检验过程有三种说法：实验室接收标本开始，直至获得检测结果的过程。 自仪器检测开始至获得检测结果。 标本开始处理至获得检测结果
4、。,基本概念,检测系统：一个检验项目所涉的仪器、试剂、校准品、测量程序（操作程序、质控程序、维护保养程序、检测用水）、操作人员、消耗品、质控品等组合。,量值溯源：是通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果能够与规定的参考标准联系起来的一种特性。（通常是国家计量基准或国际计量基准）,基质效应：处于分析物周围的基质（粘度、表面张力、离子强度等）对分析物测定结果的影响。 摩尔消光系数()：在特定条件下，一定波长的光，光径1cm时，通过所含吸光物质的浓度为1mol/L时的吸光度。,自动化分析仪概述:,自动分析仪的主要部件 加样系统 比色系统 分光系统 供排水系统 清洗系统 操作控制与数据处
5、理系统,生化分析仪结构组成,加样系统 比色系统分光系统,试剂仓进样架系统样品取样单元试剂取样单元混合部件,光源 比色杯(分立式比色转盘) 恒温装置(水浴、空气浴、恒温液循环间接加热),光栅分光式(无相差蚀刻凹面光栅), 后分光集束式光路系统,自动生化分析仪的工作程序,人工编程,机械臂代替手工,自动分析仪的基本分析方法,终点法：1点终点法2点终点法多点终点法 速率法：速率法2点速率法（固定时间法）,定标方法,对于终点法和两点速率法，必须通过使用标准液，建立一条标准曲线。 速率法检测的酶类可以采用理论因数法（K因数），但多数实验室对酶类（速率法）测试采用标准液校正Factor的方式，以消除仪器和试
6、剂的系统误差。,2点定标,两点定标：以水作为零点，标准液作为另一点，建立标准曲线。 对于一些特殊试剂如：K，Na，CL，因线性范围限制等，一般不以水作为零点，采用定值的高、低两个标准液，建立标准曲线。,多点定标,多点定标：采用两个以上的标准液来建立一条标准曲线。该曲线的特征一般为非线性，即吸光度与浓度的变化不是直线关系。免疫比浊法（胶乳增强）测定的试剂，多为此方法。因为抗原抗体反应形成的浊度的线性范围较窄。,生化试剂的分类,NAD（P）H系统指示反应,苯衍生物指示反应,H2O2偶联的指示系统,抗原抗体反应指示系统,其它显色反应,NAD（P）H系统指示反应,NADH和NADPH在340nm有最大
7、吸收峰，而NAD+和NADP+在340nm无吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据340nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。 常见检验项目：ALT、AST、CK、LDH、-HBDH、UREA、NH4+ CO2、Glu（己糖激酶法）等,NAD+-NADH系统,ALT（GPT）的测定原理：,R1：NADH 、LDH；R2：L-丙氨酸 、-酮戊二酸,试剂,化学反应,ALT L-丙氨酸 +-酮戊二酸 丙酮酸 + L-谷氨酸,LDH 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ + H2O酸,计算,ALT(U/L)= AR min/AS minC=AR minF,AR: 样本A
8、变化率 ； AS：标准A变化率 ; C：标准品示值；F:校准因素或用理论因素值（F）（F）=106/TV/SV,苯衍生物指示反应,如：p-NP(磷酸对硝基苯酚）和p-NA(硝基苯酚)指示系统：p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根据405nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。临床项目有ALP、r-GT、等。,ALP（AKP）的测定原理,试剂,R1：AMP缓冲液 、MgCl2 ；R2：对硝基苯磷酸盐,化学反应,ALP 磷酸对硝基苯酚+H2O 对硝基苯酚+磷酸盐,计算,ALP(U/L)= AR min/AS minC=AR/minF,H2O2偶联的指示系统（Trinder反应）,H
9、2O2在过氧化物酶的作用下，可使无色色素原氧化成有色的色素，导致某一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu（氧化酶法）Cr、UA等。,GLU的测定原理（氧化酶法 ）,试剂,R1：4-氨基安替吡啉 、抗坏血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）酚,化学反应,GOD葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2,计算,GLU(mmol/L)= AR /ASC,POD 2H2O2 + 4-氨基安替吡啉+酚 醌亚胺 + 4H2O,抗原抗体反应指示系统,特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗
10、体复合物，形成一定的浊度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、 C3、C4、CRP等,免疫透射比浊法，抗原抗体免疫复合物形成的浊度的 大小在合适的抗体浓度下与抗原含量成正比,试剂,R1:磷酸盐缓冲液、聚乙二醇、表面活性剂等R2（抗血清）:羊抗人apoAl或apoB,化学反应,抗原(血清中的apoAl或apoB)+抗体(抗血清试剂) 缓冲环境 抗原抗体免疫复合物,计算,吸光度-浓度曲线,其它显色反应（TP）,测定原理：蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子 作用产生紫红色络合物，导致540nm吸光
11、度的增加，增加 的程度与蛋白质的含量成正比。碱性条件酞键 + Cu2+ 紫红色络合物蛋白含量（g/L）= AR/AS C=ARFAR: 测定吸光度； AS：标准吸光度 C：标准值 F: 仪器自动换算的因数,其它显色反应（Ca2+）,Ca2+测定原理：甲基麝香草酚兰(MTB)在碱性条件下可与Ca2+形 成红色络合物，引起612nm吸光度的上升，上升程 度与Ca浓度成正比 。 碱性条件MTB + Ca2+ 红色络合物,二、检验过程常见问题及处理,1、标本处理问题及处理：放置时间过长、离心不充分、血清剥离不当等。 处理方法：应在2h内分离血清/血浆，尽量缩短时间；离心时间一般5-10分钟/3000转
12、；新采集标本 应室温（2225）放置3060分钟，使其自行 凝集后离心。不能及时做的标本分离出血清，室 温放置不超过4小时，2-4保存不超过8小时，在 -20条件下可保存较长时间。,二、检验过程常见问题及处理,2、水质问题及处理：生化用水不合格。常影响血清中离子及其他生化项目的检测，常被忽略。 处理方法：纯水分级(GB6682-2008水标准)与应用领域 三级水：电阻率0.2M/cm，主要用于冲洗玻璃器皿，水浴等； 二级水：电阻率1M/cm，用于制备常用试剂、缓冲液、仪器管道和比色杯清洗等； 一级水：电阻率18.25M/cm，常用于HPLC、原子吸收、分子生物学、细胞和细菌培养等。 生化用水：
13、电阻率2M/cm ，细菌10clu/ml或参考仪器说明书规定。电导率s/cm（微西门子厘米）1/电阻率。,二、检验过程常见问题及处理,3、交叉污染问题及处理： （1）样品针、试剂针、搅拌棒、反应杯、管路系统等清洗不干净，导致交叉污染。 处理方法：按仪器说明书要求进行保养、按要求及时更换零部件定期对仪器校准。如：每日用无水乙醇擦拭样品针、试剂针、搅拌棒，进行日保养、周保养、月保养、年保养等。,（2）检验项目间的交叉污染 相邻检验项目的干扰，A项目试剂或产物中含有B项目的测定物质或影响B项目反应，而导致B试验结果的改变。 如：Mg放在ALP项目后面测定，可能会使检测结果偏高或重复性差。因ALP试剂
14、中含有Mgcl2，使测定结果偏高等。 处理方法： 调整实验的前后顺序来消除这种影响； 在两个项目之间设定其他项目或设置清洗剂并设定清洗次数。,二、检验过程常见问题及处理,4、校准问题及处理；仪器不定期仪器校准、检测系统不校准、校准品失效或适用不当、校准品不匹配、更换试剂批号或仪器维修后不校准，导致结果不良。 校准的分类： 仪器校准/产品校准：由仪器工程师在仪器安装使用后定期进行，主 要校准仪器的光路系统、温控系统、加注系统（样品针、试剂针位置）等，通常是发给校准证书或校准报告。 检测系统的校准/功能校准：由检验人员使用校准物进行的分析校准。,处理方法： 定期进行仪器校准，当仪器维修、生化试剂批
15、号或质控出现异常时进行校准，正确选择和使用校准品，（试剂生产厂家校准品），有良好的溯源性，注意质控品的分装和保存。,5、试剂常见问题及处理：（1）试剂质量问题：（2）试剂是否在有效期内及开瓶稳定性：（3）不同试剂批号混合、新旧试剂混使用（4）试剂瓶长期不清洗使新倒入试剂被污染 （5）试剂空白（6）底物耗尽：,5、试剂常见问题及处理：,（1）试剂质量问题：试剂有效成分含量不足，导致线性范围窄，高值测定不高；试剂底物浓度不足。反应曲线斜率下降，灵敏度变低；试剂自身不稳定，自行分解，工具酶纯度不够，杂酶含量过 多，测定结果变化。,（2）试剂的有效期及开瓶稳定性：试剂是否在有效期内；试剂开瓶时间过长，
16、超过说明书中开瓶期或接近开瓶期，使试剂变质、挥发、PH改变等影响该项目的化学反应。,（4）不同试剂批号混合、新旧试剂混使用；试剂稳定的情况下，进行该项目校准得到一个F(校准因素)值，在稳定的期内，反应的吸光度变化乘以F值等于测定结果。如果试剂的成分含量发生变化，再校准后F值就会发生变化，如果还用上述的F值得出的结果不准确。 （5）试剂瓶长期不清洗使新倒入试剂被污染。灰尘、细菌、大量杂质、盐类含量高等影响测定结果。,（6）试剂空白试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标之一。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，提示该试剂是否变质；如： 利用Trinder反应（H2O2偶联）为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。空白吸光度会超过说明书限值。 ALP、r-GT等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。空白吸光度会超过说明书限值。 ALT、AST负反应，在放置过程中试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。因此，试剂空白吸光度超出试剂说明书的限值时，仪器会自动报警，提示更换试剂。,
