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1、抗肿瘤药物研究及新药筛选,赵万洲 博士 南京凯基生物科技发展有限公司 2009.10.30,提纲,化疗药物的发展 肿瘤的药物治疗 抗肿瘤新药的发现和治疗靶点 抗肿瘤药物筛选及评价,化疗药物的发展,近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。 50年代通过动物筛选化疗药物发现了5FU、MTX、CTX等，化疗学有了发展。 60年代认识到肿瘤细胞动力学及化疗药药代动力学的重要性。大部分目前所用的抗癌药已发现，有急淋、HD、睾丸癌等可化疗治愈。,70年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案。 80年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效，探索抗药性产生的原因，5%肿瘤患者可治愈。 90年代新抗癌
2、药进入临床，多药耐药基因发现，生物治疗，基因治疗辅助治疗改善等，疗效进一步提高。,1、细胞毒类抗肿瘤药 2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 3、肿瘤新生血管生成抑制药物 4、肿瘤耐药逆转剂 5、分化诱导剂 6、基因调节药物 7、单克隆抗体药物,肿瘤的药物治疗,a、拓扑异构酶抑制剂 b、胸苷酸合成酶抑制剂 c、铂类抗肿瘤药物,1、细胞毒类抗肿瘤药,原理： 真核细胞DNA拓扑异构酶（Topo )是生物体内及其重要的细胞核内酶，参与DNA复制、转录和修复等所有关键的核内过程。DNA拓扑异构酶已成为重要的抗肿瘤药物研究新靶点。拓扑异构酶抑制剂已成为高选择性抗肿瘤药物研究的一个主攻方向。代表药物：
3、喜树碱类化合物对S期的毒性作用，这一作用需共价TopoIDNA复合物的形成和DNA复制。TopoI抑制剂诱导的细胞凋亡而非DNA断裂是引起细胞最终死亡的原因。,a、拓扑异构酶抑制剂,原理： 胸苷酸合成酶（TS）把单磷酸脱氧尿嘧啶（DUMP）转换成单磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA复制和细胞生长过程中起着关键作用。是已知抗肿瘤药物的重要有效靶点之一。胸苷酸合成酶抑制剂导致了DNA断裂从而导致细胞死亡。代表药物：培美曲塞 它是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。体外研究显示，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还
4、原酶和甘氨酰核苷酸甲酰转移酶活性，这些酶都是合成叶酸所必需的酶。一旦培美曲塞进入细胞内，它就在叶酰多谷氨合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂。多谷酸化在肿瘤细胞内呈现时间-浓度性过程，而在正常组织内浓度很底。多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长，从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。,b、胸苷酸合成酶抑制剂,原理： 铂络合物产生抗肿瘤活性的原因，是由于其与肿瘤细胞DNA结合，从而干扰DNA的复制，抑制肿瘤细胞的分裂。 代表药物：顺铂和奥沙利铂,c、铂类抗肿瘤药物,a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂 b、表皮生长因子受体
5、酪氨酸激酶抑制剂 C、法尼基转移酶抑制剂,2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物,原理： PTK是一组酶系，能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活各种底物酶，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。代表药物：依马替尼依马替尼一种抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，Bcr-Abl酪氨酸激酶是CML中由费城异常染色体引起的异常酪氨酸激酶。它能抑制Bcr-Abl阳性细胞系和费城染色体阳性CML新鲜白血病细胞的增殖并诱导其凋亡。,a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂,原理：通过扩散进入肿瘤细胞，与 EGFR 的胞内段激酶结合区结合，从而抑制
6、 EGFR 受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。代表药物：吉非替尼 研究表明吉非替尼的作用通过上调 P27KIP1和 P21CIP/WAF1 的表达，导致细胞 G1 期阻滞或诱导细胞凋亡。,b、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,原理：法尼基转移酶是近年来发现的与Ras蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶。抑制法尼基转移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖代表药物：替匹法尼,c、法尼基转移酶抑制剂,原理：原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，开发和研究能够破坏或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物（称为TA 抑制剂），是新型抗肿瘤药物研
7、究的活跃领域之一。代表药物：angiostatin和endostatinAvastin Endostatin可直接与血管内皮细胞受体结合抑制内皮细胞的增生； 可与肝素样的硫酸蛋白结合，抑制血管生成； 可抑制VEGF等血管生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖 与肿瘤的生长； 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管内皮细胞凋亡加速。,3、肿瘤新生血管生成抑制药物,原理：根据肿瘤耐药的特点可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性而对其它药物不产生交叉耐药性，如抗代谢药甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生
8、耐药性，同时对其它结构上无关、作用机制各异的药物也产生交叉耐药性，这是一种独特的广谱耐药现象。许多天然来源的抗肿瘤药物如秋水仙碱、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如阿霉素、柔红霉素都极易发生MDR。肿瘤耐药产生的可能原因是药物代谢障碍、DNA修复机制障碍、DNA多聚酶活性改变等。另外，耐药是凋亡抑制的表现。一些与凋亡抑制相关的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表达产物可阻断或阻碍多种因素(如化疗药物、辐射、激素等)诱导的肿瘤细胞凋亡，产生耐药性。 研究表明MDR的产生是由于细胞内药物积聚发生障碍，此后研究证实细胞内药物积聚降低的同时，有一分子量约为170 000细胞膜蛋白过度表达
9、，称之为P-糖蛋白(Pgp)代表药物：钙拮抗药（维拉帕米及其衍生物）、钙调蛋白拮抗药（包括氯丙嗪等吩噻嗪类衍生物）、环孢素类（环孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素类化合物（他莫昔芬）等。,4、肿瘤耐药逆转剂,EXTRACELLULAR INTRACELLULAR,ATP,PGP170 ATP,Drug,Drug,Plasma Membrane,环胞菌素A(CsA)是一种从真菌属中提取的天然药物，具有选择性的免疫抑制功能，广泛用于器官移植后的抗排斥反应及治疗免疫性疾病。它能竞争性的和Pgp结合，阻断Pgp泵出药物的功能，提高胞内药物浓度，从而对抗MDR，通过进一步研究
10、表明，CsA的作用机制并非单一，除了通过结合Pgp而调节药物浓度外，还可通过与细胞内，靶结构之间的相互作用而增加化学敏感因子自身的细胞毒性。CsA在MDR中可调节药物的运输，使抗癌药在细胞内积累增加，外排减少，从而增加抗肿瘤药物的敏感性。,原理：通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小、消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂。代表药物：维A酸类化合物咪唑衍生物利阿唑,5、分化诱导剂,维A酸类化合物维甲酸类化合物(Retinoic acids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维
11、甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA)，它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件，从而调节靶基因的转录。,“Right now we lump patients together and treat them with the same drugs and then deal with their variable response to treatment. Were essentially treating different diseases with the same medicine.”Richard Klausner, 1997,a、反义药物 b、
12、Decoy核酸 C、RNA干扰,6、基因治疗,a、反义药物反义药物又称反义寡核苷酸药物（AODNs） ，是指人工合成长度为1030个碱 基的DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的 基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。 AODNs 可以与其靶RNA链互补结合，形成RNA-DNA杂交双链。形成的杂交双链可以被RNA酶H识别并消化RNA链，由此释放出的 AODN可以继续与靶RNA链结合，最终导致编码基因沉默。由此可推RNA酶H过多表达可增强各种AODNs效应，反之RNA酶H受抑则降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反与翻译元件竞争空间因此可抑制RNA
13、翻译。另外，AODNs 如果和mRNA结合可作用于内含子外显子接合处以中断其拼接过程。AODNs还可以占领校正RNA细胞内定位的蛋白RNA作用序列，从而扰乱RNA运输，药物：Vitravene,a、反义药物,Decoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 .体外筛选结合转录因子AP2的decoy核酸药物 ,结果K102对多种肿瘤细胞生长有显著的抑制作用 ,在异植人肿瘤细胞NCIH460的裸鼠模型中 ,静脉注射高中低三剂量组的decoy核酸K102 ,抑瘤率分别达 71.8%、64.4
14、%及 57.3%.通过凝胶阻抑试验 ,验证了K102与转录因子产生特异性结合 .实验结果为decoy核酸转录调控药物的研究提供了依据。,b、Decoy核酸,Design oligos which can specifically bind to the transcription factor JUN/ATF and block downstrean multiple oncogenes expression,RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病
15、毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。,c、RNA干扰,单克隆抗体(单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的抗体。起初用于诊断剂或检测剂，后来用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治疗肿瘤的优越性：（1）单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用 （2）单抗药物具有更高的疗效（3）单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用其研
16、究重点主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。目前，国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞，利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。,7、单克隆抗体药物,代表药物：曲妥珠单抗（trastuzumab， Herceptin ）Trastuzumab为靶向结合HER2的人IgG1类单抗，HER2为酪氨酸激酶受体，在约20%25%的进展期乳腺癌患者过表达。HER2分子具有以下的特点，因此成为乳腺癌治疗的靶分子：HER2的表达水平与乳腺癌的发病机理及预后相关；肿
17、瘤的HER2表达水平及基因拷贝数远高于正常组织，有效的减轻了HER2靶向治疗药物的毒性；HER2表达阳性的肿瘤细胞比例很高，而且在肿瘤细胞表面高表达，因此在患者体内可以靶向大多数的肿瘤细胞；HER2在原发肿瘤及转移灶均有表达，因此HER2靶向治疗对原发及转移病灶均有效。,曲妥珠单抗（trastuzumab）的作用机制：抑制受体信号传导。HER2可以活化多种信号传导通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab减少了这些信号通路的传导，将细胞阻滞于调定点，诱导细胞凋亡。受体信号传导的降低是由于trastuzumab介导的HER2受体内化及降解。 通过调节p27kipl阻滞细胞于G1调定点
18、。Trastuzumab处理的细胞被阻滞于G1调定点，细胞增殖减少。细胞阻滞于G1调定点与细胞周期依赖的激酶抑制蛋白p27kipl相关。 诱导细胞凋亡。体内研究表明trastuzumab可以诱导乳腺癌细胞凋亡，凋亡的发生与Ki67的表达无关。 抑制血管形成。高表达HER2的肿瘤细胞新生血管及VEGF的表达显著增加。体内研究结果显示trastuzumab处理后，乳腺癌肿瘤体积减小，微血管密度降低；体外研究表明trastuzumab处理后，内皮细胞的迁移能力下降。 抑制DNA修复。体外研究显示可与许多化疗药物产生协同效应。Trastuzumab或联合化疗药物促进DNA损伤，并抑制DNA的修复，最终导致细胞凋亡。,
