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1、第三节 DNA多态性分型技术,四川大学华西公共卫生学院 汪川,什么是DNA多态性?,多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。 从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。,DNA多态性对微生物有哪些实际意义？,将导致 不同的细菌亚型 耐药菌株出现 毒力变异株出现 抗原漂移与抗原变异 。,在疾病预防控制中的应用,同源性追踪 细菌分型 传染控制,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多
2、态性分析 随机扩增多态性DNA分析技术 细菌基因组重复序列PCR技术 扩增片段长度多态性分析技术（自学要考） 脉冲场凝胶电泳 。,一、限制性片段长度多态性分析 restriction fragment length polymorphism，RFLP,以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用,每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的DNA作探针，将与被标记的DNA相关的片段检测出来，即可构建出
3、多态性图谱。,基 本 原 理,因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态性。,基 本 原 理,基本方法,提取基因组DNA,制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳,DNA变性、转膜、固定,核酸杂交,显影、显色、分析,限制性内切酶 (restriction endonuclease， RE）一类能识别环状或线性双链DNA特定核苷酸序列的DNA水解酶，在合适反应条件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。,内切酶的命名规则 前三个字母代表其来源的细菌种名，用斜体字母，第四个字母代表菌株名称，如
4、果同一株菌有不同限制性内切酶系统，则不同的内切酶系用罗马数字区分。例：EcoRI代表该酶来源于E. coli的R菌株。,琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪,转移电泳槽,核酸分子杂交的概念及原理,核酸杂交: 两个不同来源的、含有互补核苷酸顺序的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程。,核酸经加热变性后，在低于变性温度20 30时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。,核酸分子杂交技术原理,根据探针上的标记，可用放射自显影或加入酶底物显色的方式观察结果。,优点 1可靠性较高 2来源于自然变异 3
5、标记覆盖面广,优 缺 点,缺点：,检测步骤多，周期长； 对DNA需求量大，一般需要5l0g，纯度要求较高； 技术复杂，操作繁琐，工作量大； 具有放射性的危害； 检测成本高。,讨论：RFLP与脉冲场凝胶电泳都是根据基因组上的限制性内切酶位点的多态性来对生物进行基因分型的，那么它们两者的异同点有哪些呢？,基于上述RFLP的缺点，一种更好的分析技术聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术 （PCR-RFLP ）应运而生。,结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不
6、同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。 思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？,基本原理,根据名称： PCR-RFLP猜想本方法的原理？,1. 提取DNA 2. 设计特异引物进行目的基因PCR反应 3. 将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切 4. 将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离 5. 对显示出来的带谱进行分析。,基 本 程 序,根据基本原理思考基本程序？,优 缺 点,优点： 敏感性高。 操作简便省时。 缺点： 影响因素较多。 不能完全区分基因非常相似，甚至只有一个核苷酸差异的生物类型。,RFLP与PCR-RFLP的应用,结核分枝杆菌IS6110-R
7、FLP分析 厌氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析 其他,二、随机扩增多态性DNA分析技术 random Amplified Polymorphism DNA， RAPD,以PCR技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，经电泳分离后产生DNA指纹图谱。,模板DNA经9294变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。,基 本 原 理,RAPD所用的一系列DNA引物序列各不
8、相同，但对于任意特定引物，它同基因组DNA序列有其特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。,基 本 原 理,总DNA提取,随机引物合成,PCR扩增,随机引物筛选,电泳检测,图谱分析,采用随机引物，无需预先知道被研究生物基因组核苷酸序列； 引物短，在整个基因组内的结合位点多，2种甚至多种引物可混用； 成本较低； 操作简便，快速； DNA分析效率较高； 所需DNA样品少。,优 点,重复性不高（最大缺点）； 只能区分不同大小的片段，而不能区分有不同碱基序列但大小相同片段； 需对
9、引物进行筛选，难以进行标准化。,缺 点,三、细菌基因组重复 序列PCR技术 （repetitive-element PCR, rep-PCR） 一种基于PCR的DNA标记技术,rep-PCR技术是利用基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequences)为引物进行PCR扩增，通过对PCR产物的电泳结果进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异。,rep-PCR-原理,目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有：,rep-PCR-短重复序列,基因外重复回文序列 （Repetitive Intergenic Palindrome,REP),肠细菌基因间共有重复序列 （Entero-
10、bacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC),两者的共同特征是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的保守性。,基于这两种短重复序列的PCR就成为rep-PCR的2个重要的技术REP-PCR和ERIC-PCR。,rep-PCR-短重复序列,两种短重复序列的特点及功能：,基因外重复回文序列（REP）又称回文单位，其结构特点是回文性质，其转录的mRNA有形成茎-环（stem-loop）结构的潜能。REP家族序列由38bp构成，含有6个非常保守的位点及5bp构成的位于非常保守的回文臂之间的
11、保守环。,REP序列,rep-PCR-REP序列,REP家族序列广泛分布在大肠埃希菌和沙门菌基因组内(提示什么？）。REP序列可以单独出现或增加为4个串联的重复单位。在E.coli的染色体上，存在500到1000个的REP串联重复单位，在沙门菌上REP串联重复单位约占基因组的1%。,rep-PCR-REP序列,REP序列的功能：,rep-PCR-REP序列,转录终止作用；,稳定mRNA；,在体内染色体区段的组织作用。,根据REP这段高度保守的重复序列设计引物，扩增两段REP之间的片段，扩增产物的数量和片段长短的不同就直接反映了基因组DNA的差异，从而可对菌株进行分型和同源性分析，这就是rep-
12、PCR技术中的REP-PCR技术。,rep-PCR-REP-PCR技术,肠细菌基因间共有重复序列（ERIC）长约126bp，其中包含几个反向重复序列，具有非常保守的中央倒置重复区，转录后的mRNA形成茎-环结构。当茎环结构中位于茎部位的一个碱基发生改变时，与其相对应的碱基也要发生相应的改变，从而保证二级结构的稳定。,rep-PCR-ERIC序列,结构特点,ERIC序列的功能目前还不太清楚，在一些研究中，ERIC被认为：可能有助于相邻基因的表达；也可能与细菌基因组局部区域的组织有关；或认为位于基因3末端的ERIC可防止外切核酸酶对基因3末端的降解。,rep-PCR-ERIC序列,功 能,依据ER
13、IC重复序列设计引物，对细菌基因组DNA进行扩增，可产生DNA指纹图谱。在一定范围内，DNA迁延带的大小和多少代表着此重复序列间的距离和重复次数，因此，基因组DNA的差异可清晰地显示在指纹图谱上。这就叫rep-PCR技术的ERIC-PCR技术。,rep-PCR-ERIC-PCR技术,（1）指纹图谱稳定；,rep-PCR-优点,（2）对基因组DNA提取要求不高；,（3）对模板DNA没有严格的要求；,（4）灵敏度高。,DNA模板提取,设计引物,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,结果分析,rep-PCR-操作流程,在李斯特菌种、株分型中的应用,在其他菌株分类中的应用,在肠杆菌科细菌分类中的应用,rep-PCR-应用,Thanks!,
