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1、地中海贫血的实验室检测和结果分析,广西区人民医院检验科PCR实验室 李友琼,主要内容,一、什么是地中海贫血及分布 二、地中海贫血的致病机制 三、地中海贫血的基因诊断 四、最新的地中海贫血检测方法 五、检测结果分析及报告,一、什么是地中海贫血,定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋 白肽链合成减少或缺失，导致血红 蛋白的链/非链比例失衡，而引起的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血。血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白分子的一级结构发生改变，从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。,地中海贫血分类,地
2、中海贫血分类,1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定义0地贫（也有称地贫1） ：-珠蛋白基因完全 基因记为-/ 丧失功能。+地贫（也有称地贫2）： -珠蛋白基因保基因记为-/ 留有部分功能。,地中海贫血分类,2、按照肽链内切酶分型缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造成功能缺陷非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是 （点突变） 由于基因的点突变造成的肽链功能缺陷,地中海贫血分类,3、根据基因缺失或突变个数可分为：静止型： 缺失1个基因，基因型记为-/1个基因突变，基因型记为/T 轻型： 缺失2个基因，基因型记为：-/或-/-2个基因突变，基因型记为： T/T 中间型： 缺失3个基因
3、，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T或纯合突变 重型： 缺失4个基因，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T,地中海贫血分类,1、根据肽链的功能缺失 0地贫 ： 珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链 地贫 ： 珠蛋白基因尚保留部分功能2、根据临床症状 静止型地贫： 突变杂合子（ N/ +），中国人少见 轻型型地贫：突变杂合子（ N/ +、 0/ N） 中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（ +/ +、 0/ +） 重型地贫： 突变双重杂合子/突变纯合子（ 0/ 0、 0/ +）,中国人HPFH和-地贫的基因突变类型及表型特征,世界地中海贫血的流行分布,广西地中海贫
4、血的流行分布,Xiong , et al. Clin Genet 2010,广西地中海贫血的流行分布,引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布, MC,10kb,0kb,20kb,30kb,40kb,10kb,3HVR,inter HVR,5,3, 2 1 2 1 , THAI, BRIT, FIL, MED, SEA, 4.2, 3.7, 2.7, SPAN, HW, 27.6, 11.1, 2.4,Black Belgian Indian Malaysian 2 German Turkish Italian Gantonese Yunnanese Chinese S.E.Asian Tai
5、wanese,0kb 50kb 100kb 150kb, G A ,LCR,引起地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步,12 种见于中国人群的 2/ 1珠蛋白基因点突变,CD31,CD125,EXON I,EXON II,EXON III,IVS I,IVS II,UTR,UTR,5,3,CD13,CD59,CD122,CD142,CD44,CD49,CD30, 2, 1,Missense mutation,Mini deletion or insersion,Termination mutation,Frameshift,http:/globin.cse.psu.edu,CD78,CD74,C
6、D118,启动子突变 异常剪接 起始密码突变 移码突变 无义突变 3UTR突变,EXON 1,IVS 1,EXON 2,EXON 3,IVS 2,显性突变,5,3,46 种见于中国南方人群的-珠蛋白基因点突变,http:/globin.cse.psu.edu,中国南方人群最为常见的地贫类型,二、地中海贫血的致病机制,胎儿血红蛋白主要由两条珠蛋白链、两条珠蛋白链组成，还含有 链、链、链组成 成年人的血红蛋白由两条珠蛋白链和两条珠蛋白链组成,血红蛋白,二、地中海贫血的致病机制,二、地中海贫血的致病机制,人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律,二、地中海贫血的致病机制,静态突变,点突变,片段突变,动态
7、突变,碱基替换移码突变,串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加,缺失 重复 重排,基因突变的分子机制,基因致病突变是地贫发生的分子基础,二、地中海贫血的致病机制,三、地中海贫血基因分析,1、Gap-PCR 用于和等缺失型地贫的检测,原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。,三、地中海贫血基因分析,2、PCR-RDB 用于检测和点突变,PCR,膜条,杂交,显色,三、地中海贫血基因分析,地贫基因检测的策略：地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点 突变），最后是未知的缺失和突变位点。因为90% 地贫
8、为常见的三种缺失型（-sea,-3.7,-4.2)。 地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。大部分地贫都是点突变型。,血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程,遗传咨询,产前地贫携带者筛查策略,同时正常,产检对象（孕妇及其配偶）,地贫分子诊断,知情同意选择,胎儿产前基因诊断,血液五分类分析（关注MCV和MCH）+血红蛋白电泳（Hb A2),双方某项指标 均同时降低,一方正常，另一方的指标降低,地贫全套检查,异常的一方做地贫全套检查,-地贫特征,-地贫特征,ID,双方均为 -地贫特征,一方为-地贫特征，另一方为ID或-地贫特征,+,-,单纯性ID或单纯性-地贫,双方均为 -地贫特征,ID或-地贫
9、特征的一方 做地贫分子诊断,夫妇双方基因诊断,血R正常的 一方做地 贫分子诊断,-,单纯性ID或单纯性-地贫,-,+,+,仅异常血红蛋白,必要时测序或选择其中一种地贫检测,四、最新的地中海贫血检测方法,1、融链曲线分析法 用于检测或缺失和点突变,Thongperm, et al. Journal of Molecular Diagnostics .2010 Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011 Christina V，et al. Clinical Chemistry. 2003,原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断,四、最新的地中海贫血检
10、测方法,2、MLPA（多重连接探针扩增）用于寻找未知缺失断裂点,Xiao-Feng Wei，et al. Ann Hematol. 2011,四、最新的地中海贫血检测方法,3、毛细管电泳 可以检测非缺失CS（Hb CS)和 E地贫,Hb A,Hb E,Hb A2,Can Liao, et al. European Journal of Haematology. 2010,四、最新的地中海贫血检测方法,4、DHPLC（变性高效液相色谱）用于缺失型和突变型地贫都可以,李倩，南方医科大学论文，2010,四、最新的地中海贫血检测方法,5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）用于未知突变位点或确定缺失片段
11、的位置由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线 推广，只在科研实验室里开展。,Azam Amirian MSc， et al. Archives of Iranian Medicine. 2011,四、最新的地中海贫血检测方法,6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,五、检测结果分析及报告,（一）地贫基因诊断,1、 - -SEA / 2、 / 3、 / 4、- -SEA /-4.2 5、- -SEA /-4.2 6、- -SEA /-3.7 7、 / 8、 - -SEA / 9、 DNA Marker,缺失型地贫
12、电泳结果,1 2 3 4 5 6 7 8 9,非缺失杂交结果,CS纯合,WS杂合,未检测到6种突变,（注意不是正常）,A,B,C,D,E,F,地中海贫血点突变分析结果,血涂片染色（包涵体）,Cornelis L H，Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010,五、检测结果分析及报告,（三）基因诊断报告单 1、临床地贫基因报告主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的签名，诊断结果以及临床提示。 2、临床科研报告由于常规检测不到，但是患者又必须进一步检测确定的罕见或未知地贫类型。报告信息只包括被测样本信息，检测方法，检测试剂，诊断结果及临床提示，没有检测者的签名（不承担法律后果）。,地贫基因分析诊断报告单（ alpha 地贫）,新修改的报告单,珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制,谢 谢,
