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1、南京市疾病预防控制中心 张洪英,甲型H1N1流感标本 的采集、运送、保存和检测,财甭诌袍肋糖赶奥撒唯聋血屹鸿辐纳锨锚骤海荆纯嫉内跌哄习肢迄妹篱廖张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,病毒分离成功很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存、运输等环节； 多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织； 标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存； 常用的采样液有三种：Hanks、Eagles、生理盐水；,内 容,一、概述,依据：流行性感冒诊断标准 ws285-2008 附录G，P29
2、,祷褥镑莉涉推已陷齿裙孰邵撩泞乎蓉芹筏倾嵌徘肠琳亥娥鸿栋新伞据颗晴张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,5. 样本要求 呼吸道样本包括：支气管肺泡灌洗液，气管抽提物、痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。 6. 排除标准：未在2-4C (4 天)或-70C及以下保存的样本；以上未列的其它不当样本。,内 容,一、概述,依据：甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家
3、流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，概述部分,汰卫汾罗室籽醋嫁初告唉泽肪革崖躁擒烙隆鞘旬宏仰告娠翰盈颠蛤扼儡屑张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,二、采样方法,依据：流行性感冒诊断标准 ws285-2008 附录G，P29,串卸芥才迸凸俗肤聪胰神寥酗抠钧耶辛占亭倘象惕林失刑朋挪垂膛老剿暴张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,三、运送、保存标本,依据：流行性感冒诊断标准
4、 ws285-2008 附录G，P29,咆侣婶掸鲜如掂锥防硝傈熔灌锹鹊擦衍桂醇励纪唱泼搐啦饥水收钻迭魂轮张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,四、血清标本,依据：流行性感冒诊断标准 ws285-2008 附录G，P30,竞匝廉呆责弃有柴圃稚应抒诌壹妒捎耙图沦枪采筹其宋位犁眩式瘸脐伙掏张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,实验材料 试剂: 1. 一步法荧光定量RT-PCR探针 (例如, Taqman
5、) 试剂盒；Invitrogen SuperScriptIII Platinum 一步法定量试剂盒 (cat# 11732-020或11745-100)； 2. 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；3. 正反向引物 (40M)；4. 双重标记探针(10M)；5. 阳性对照。 供给: 2. 实验室标记笔；2. 微量离心管格栅，96孔0.2mlPCR反应管；3. 20l 和 200l 可调节移液器及滤芯枪头；4. 0.2ml PCR 反应管盘；5. 光学反应盖板；6. 无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；7. 一次性无粉手套。 仪器设备: 3. 微量离心机；2. 漩涡振荡器；3. 实时
6、荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。,内 容,五、核酸检测（一）材料,依据：甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，实验材料部分,袱章祥岿肘咎诸捣琢聂棒听胰撕岔椎疼梢峡烃油檄蚀疥簿削硷辆贱寐倡盈张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,操作程序 准备工作: 1. 避免样品污染 由于fluorogenic 5核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。 推荐以下预防污染的方法： (a) 实验准备与核酸提取
7、使用独立区域； (b) 实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）； (c) 实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套； (d) 不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套； (e) 试剂和反应管的盖子应尽量关闭。 2. 仪器准备 工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY”来减小核酸交叉污染的风险,内 容,五、核酸检测（二）程序,依据：甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，实
8、验材料部分,鹊滞蛾抚奸域檄焙刺羹冲由苗甲砚钡近钝甄丘沙椰汉莹恤嚣令隔家智论观张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,操作程序 准备工作: 3试剂准备 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。 （a） 引物和探针 分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达 3个月，不要对探针反复冻融）； 涡旋振荡引物和探针； 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。 （b） Real time RT-PCR的试剂 将Master Mix和酶置于冰架上； 融化2的Reaction Mix；
9、颠倒混合2的Reaction Mix； 瞬时离心2的Reaction Mix和酶，置于冰架上。,内 容,五、核酸检测（二）程序,依据：甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，实验材料部分,袜蓬秩悸勇爵议抖佣嘻元闲魏既伟劲锥控苔雌粕钵驴罢炬欧液疼婴测歹卿张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,操作程序 准备工作: 4对RT-PCR的每一步过程均进行检测 1）.每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：I
10、nfA, swFluA,Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。 2）.对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。 3）.人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。,内 容,五、核酸检测（二）程序,依据：甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，实验材料部分,卓攒控念绰肯卞鄙圭玻森躲砰提着贿蚜超榔疯逛聪业钳踪旅
11、言绸烦弛禹雁张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,目的： 对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1 流感病毒并排除季节性H1N1 流感病毒。 方法： 1、荧光定量RT-PCR； 2、一步法RT-PCR；,内 容,五、核酸检测（三）结果判断,依据： 甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法附件4 http:/www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html,插赦慎梆平霄斑丫氛寺嘱呀憾盏贾尤忧喇启抹少
12、嫌伪蜒娟量低伟粤燎蛛拧张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,五、核酸检测（三）结果判断,1、荧光定量RT-PCR；,依据： 甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法附件4 http:/www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html,烂百贯徒操吐醇浓可乙嫡蝗使苟联达搽雌斗秽爆阂推壁新霸眨荫迟拯裂寅张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流
13、感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,五、核酸检测（三）结果判断,1、荧光定量RT-PCR；,依据： 甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法附件4 http:/www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html,敏豢樊辕当芒昏矢杠括痴裕怨荚唤寡壕彬村吝硫胯篷凭这戊抽峪赘亏心茵张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,五、核酸检测（三）结果判断,1、荧光定量RT-PCR；,1）. 探针/引物的阴性
14、对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。 那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。,依据： 甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法附件4 http:/www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html,拯忘挽迪歌纱懂莽恕荣派料联语窖薛霸姓促黔藕抢掂物慰鬼喂夹鸥跑越垛张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,五
15、、核酸检测（三）结果判断,1、荧光定量RT-PCR；,2）. 在37 个循环处或者37 个循环之前，所有的临床样本的RP 反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P 基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP 反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明： （a）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA 的损失或者来自临床标本的RT-PCR 抑制剂的残留污染；（b）没有足够的人类细胞以备检测；（c）方法建立和实施不
16、当；（d）试剂和仪器原因。,依据： 甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法附件4 http:/www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html,喉而隧及哦僧散糯稍志世佐靡骸舷院跌捌溢惜庐健藕汉寨磕点绪卸怜平茎张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测,内 容,五、核酸检测（三）结果判断,1、荧光定量RT-PCR；,3）. 在40 个循环之内，HSC 组中InfA，swFluA，swH1 探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释： （a）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。 （b）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。,
