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1、Office: Room 409 of Experiment Building No. 3: 06358230050 ,: : 448953745,基因工程 Genetic Engineering,1,Office: Room 409 of Experiment Building No. 3: 06358230050 ,: : 448953745,第2章,基因工程的工具酶,2,Enzymes involved in genetic engineering,1.Restriction enzymes-cutting DNA（切割）,基因工程中常用的三大类工具酶分别与DNA的切割、修饰、连接有关。
2、,2.DNA modifying enzymes （修饰）,3.DNA ligase - joining DNA （连接）,Nucleases（核酸酶）Polymerases（聚合酶）Enzymes that modify the ends of DNA molecules （末端修饰酶）,基因工程中常用的三大类酶分别与DNA的修饰、切割、连接有关。,Contents,1.限制性核酸内切酶,2.DNA修饰酶,3.DNA连接酶,重点与难点内容,各种工具酶概念及其基本性质 各种工具酶在基因工程中的应用 限制酶与修饰酶,重点,基因工程工具酶的应用,难点,1.Restriction endonucle
3、ase（限制性核酸内切酶）,一类能识别dsDNA分子内部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸酶 来源：主要从原核生物中分离纯化而来 II型核酸内切酶：2300种以上，可识别230种不同的DNA序列（1994年，美国，分子生物学百科全书）,目前发现有限制性内切酶的生物主要是细菌，少数霉菌和蓝藻。,To date, over 10 000 microbes from around the world have been screened for restriction enzymes. From these, over 3000 enzymes have been found repr
4、esenting approximately 200 different sequence specificities.,*,,Discover of restraction endonulease,这种大自然赋予基因工程学家的了不起的礼物是如何发现的呢?,1.1寄主控制的限制与修饰限制 （Host-controlled restriction and modification）,大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在这一些功能性障碍。 如：目前尚未发现有任何一种既可感染假单胞菌又可感染大肠杆菌的噬菌体，且非寄主细菌的RNA聚合酶不能够识别“外源”噬菌体的启动子，即使噬菌体的吸附和转录能进行，也仍
5、然存在这一功能障碍即为寄主控制的限制和修饰现象,吴乃虎，基因工程（第二版，上册），P122,*,1.1寄主控制的限制与修饰限制 （Host-controlled restriction and modification）,瑞士学者W.Arber 1952年发现这种现象，1978年获得诺贝尔奖。,Werner Arber,*,这种现象类似于人体的免疫系统，它可辨别自身的DNA和外来的DNA，并使后者降解它是限制性内切酶被发现的基础。,Phenomenon,K, （B）, （K）, （B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的噬菌体,第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制,K, （K）,存活下
6、来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制,为什么呢？,说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA； 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,EOP:Efficiency of plating(生长在不同寄主中的噬菌体的成斑率，表示限制程度)。,What is the reason,研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶（1962年）,？,甲基化酶：能使自身的内切酶识别序列的碱基发生甲基化，从而使自身DNA免受内切酶切割而降解细菌的“防御”系统（盾）,核酸内切酶：识别并切割酶解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰
7、作保护）（矛）,限制一修饰体系：其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA,用这两种酶来解释： Host-controlled restriction and modification,再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（因为菌株的甲基化酶已经对其进行了修饰，加以保护）, （B）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，形成的嗜菌斑非常少（因为其DNA大部分被胞内的内切酶降解了，但有极少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。）,*,K, （B）, （K）,K, （K）,是指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，降解入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物
8、细胞的入侵受到限制。,*限制作用,是指生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过甲基化酶的修饰，免遭自身限制性酶的破坏。,限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。,*修饰作用,1.2 限制性内切酶的类型 Types of restriction and modification (R-M) system,Type I (1%):种类少 Type II : 98% TypeIII: (1%),I型和III型:通常都是大型的多亚基的蛋白复合物，既有内切酶的活性，又有甲基化酶活性。辅助因子也较多，除了镁离子外
9、，还需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM） ，这样才能表现出正常的限制活性。,Type I RE,识别位点：未甲基化修饰的15bp左右特异序列，非对称性。,酶切位点：在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链,作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 I 型限制性内切酶具有极强的ATPase的活性，每打开一个磷酸二脂键就需要消耗1000个分子的ATP。 因酶切位点不特异，在基因工程中无意义【】 。,Type III RE,III型限制性内切酶兼有限制-修饰两种功能，可以特异地识别DNA，但酶切位点在识别位点下游515bp的地方。 辅酶：ATP和Mg2+ 在基
10、因工程的意义？,Type II RE：基因工程中重要的工具酶！ 精彩马上开始！,（一）Type II RE：限制性内切酶的性质特征,1. Recognition sequences size：4-8bp，多数6bp,*,2 . 结构特征：rotational symmetry-“palindromes”（旋转对称的回文结构）,3. 切割后产生的末端：Cohesive terminus or Blunt end（粘性末端或平末端）,例1：EcoR I的识别序列,回文序列：指在双链DNA序列中按确定的方向阅读，双链中的每一条链的序列都是相同的。,Recognition sequence(识别序列)
11、,简并识别序列,有些酶的识别序列不是一个，而是多个。 在基因重组时要尽量少用这些酶,例2：,Cutting site（切割位点）,切割位点多数在识别序列的内部，少数在两端，部分在两翼。,部分在两翼,少数两侧/端,多数在内部,Site preference（偏爱位点）,Certain restriction endonucleases show preferential cleavage of some sites in the same DNA molecule. 相同的DNA分子，有些限制性内切酶会对一些位点表现出偏爱性的切割。这些位点就是限制性内切酶的偏爱位点。 切割位点两侧序列的核苷酸组
12、成与切割效率有关，即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割。,*,Site preference（偏爱位点）,原因 1.边界碱基的辅助识别：与识别序列邻近的特异性边界碱基可以提高酶切速度，对酶的识别起到辅助作用。 2.甲基化：限制酶识别序列内或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的活性。（限制与修饰现象。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。） 3. 底物的构象：DNA分子的不同构型对限制酶的活性也有很大影响。有些酶切割超螺旋DNA和线状DNA时会表现出差异。,*,Cohesive terminus and blunt end（粘性或平末端）,1. Cohesi
13、ve terminus (end) (粘性末端）：在对称轴5侧或3切割底物, 使得DNA双链交错断开，产生具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。,*,2. Blunt or flush end (平端)：在对称轴上同时切割DNA的两条链，产生的末端平整，不易于重新环化。,3. 非互补的粘性末端：酶切位点在识别序列之外的。, 5粘性末端(protruding 5 ends),31, 3粘性末端(protruding 3 ends),32, 平末端（Blunt End）,33, 非互补的粘性末端,粘性末端的意义或者在基因工程中的作用, 连接便利 a)不同的DN
14、A双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平末端要容易的多。 b) 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,35, 末端标记 a) 凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。或者用DNA聚合酶补平5粘性末端来标记。 b) 凸出的3末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端或标记。 补平或削平成平末端 5粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平末端。 3粘性末端可以用T4 DNA Pol 或S1酶削平成平末端。,36,（二）Type II RE：稀切酶、同裂酶与同尾酶,稀切酶（rare cutting enzyme
15、s） 在DNA分子中出现的几率低，故称之为稀切酶。识别序列比较长；富含AT或富含GC。,同裂酶(Isoschizomer) 【】,来源不同的II型限制性内切酶，具有相同的识别序列时，称为同裂酶(Isoschizomer)。 有2种情况： 酶切以后的残端完全相同： 酶切以后的残端不同：,38,同尾酶(Isocandamers) 【】,来源不同，识别序列也各不相同，但酶切以后的残端相同，这种情况称为同尾酶(Isocandamers).,由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用！,同尾酶的粘性末端互相结合后开成的新位点一般不能在被原来的酶识别 ,WHY？,Q：
16、你能推断出这两个酶的识别序列吗？,I,Qize,用限制酶将Sau3AI(GATC)切割的DNA与经BamHI (GGATCC) 切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的几率有多少？,（三）Type II RE：切点在DNA上出现的频率,II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率受DNA的长度、识别位点的长度以及GC含量的影响。 4bp的识别位点：1/44256 bp 如：HaeIII GGCC 6bp的识别位点：1/464096 bp 如Eco RI GAATTC,（四）Type II RE：甲基化对活性的影响,大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：,
