食品酶学第三章

《食品酶学第三章》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品酶学第三章（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第三章,酶的分离和纯化技术,本章重点,各种分离方法的操作原理 分离方法的应用原则 酶分离纯化中应注意的问题,酶制剂的来源,解决问题？,如何提高酶的回收率 和纯度质量,Purpose？,获得一定量的、不含有 或少含杂质的酶制剂或 者提纯为结晶，以利于 在工业生产或科学研究 中应用,建立一个可靠和快速的检测酶活与纯度的方法，并对整个分离过程中每一步始终贯穿酶活力的测定。 了解所分离酶的结构与性质特点以及酶在细胞中的存在状态。 明确原料的特性与数量。 了解各种方法的原理特性和优缺点并选择有效的分离纯化方法。 各种方法的使用顺序安排合理。 时刻防止酶的变性，操作要在温和或低温的条件下进行。 要充分考虑

2、到介质与溶液体系中各种因子的影响和实际的实验条件。,考虑因素,本章主要内容,第一节 酶的分离纯化程度 第二节 酶的抽提 第三节 酶溶液的浓缩 第四节 酶的分离提取 第五节 酶的纯化 第六节 酶的提纯标准,表31 从 E. coli中分离、纯化天冬酰胺酶,从表31可知，随着分离、纯化过程，酶的比活力越来越高，提纯程度越来越高，其提纯倍数也越来越大，而其总活力、回收率相对降低。一般试剂级及药品级酶纯度要求高，则采取提纯倍数高的方法。工业用酶对纯度要求较低，其成本价格显得重要，甚至有时采用粗酶液。而食品级酶在整个分离、纯化工程中要注意卫生、防止污染，各方面均须综合考虑。,本章主要内容,第一节 酶的分

3、离纯化程度 第二节 酶的抽提 第三节 酶溶液的浓缩 第四节 酶的分离提取 第五节 酶的纯化 第六节 酶的提纯标准,第二节 酶的提取,一、酶原料的选择 二、酶源材料的预处理 三、酶的抽提,一、酶原料的选择,1.遵循的原则 酶含量多、干扰物少；来源丰富、保持新鲜；容易得到、提取工艺简单；稳定性好、安全性好；有综合利用价值等。例如：提取生姜蛋白酶应该以姜的根部为原料，提取淀粉酶则应以培养的微生物为原料。,2. 注意的问题1）酶存在胞内酶和胞外酶之分，一般而言，胞内酶比胞外 酶难于提取。2）材料不同，同一材料不同部位或不同生长期，酶的含量不相同。如：脂肪氧化酶在大豆中的含量是在花生中含量的100倍。3

4、）同一种酶在动物材料、植物材料、微生物材料中性质不同，安全性也不同。4）选择到合适的材料后应及时使用，防止酶的破坏。5）植物材料具有一些不利于酶提取的因素，如含有较高的纤维素、色素和单宁；细胞不易破碎；液泡中代谢物复杂等。,6）动物脏器中含有较多的脂肪，容易氧化酸败导致原料变质，影响纯化操作和酶的得率。7）微生物具有种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节地点影响等优点，并且可以通过微生物培养方法富集诱导酶，因此已成为制备酶的主要材料之一。8）采集的材料在正式进行酶的提取之前，一般都要进行一定的前处理，去除明显可见的杂质和干扰物质。,二、酶源材料的预处理（胞内酶）,机械破碎法 物理方法 酶

5、解法 表面活性剂处理法 丙酮粉法,机械破碎法包括研磨法和细菌磨法研磨法 细菌磨法此法比研磨法省力，其破碎率也比研磨法效率高。,细菌磨结构示意图,物理方法,超声波破碎法,渗透压法,冻融法,基本原理是利用超声 波（10-15KHz）的机 械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生时的 空化作用，致使液体 形成局部减压引起液 体内部产生很大的压 力导致细胞破碎。,先将细胞置于高渗溶 液（如蔗糖溶液）中 平衡一段时间后，突 然将其转入到低渗缓 冲液和水溶液中，细 胞壁会因为渗透压的 突然变化而破碎。,将细胞在低温（-15） 下冰冻后在在室温下 溶化，如此反复多次 就能使细胞壁破裂。 此法也只适用于细胞 壁易

6、破的细胞。冻融 过程要迅速，不能 很长时间（速冻速溶）,酶解法,用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶（如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等）在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。例如：用酶法破碎酵母细胞时，需要先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构；甘露糖酶可以专一的水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的结构破坏。另外再加入葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改变渗透压使细胞膜破裂，胞内物质溶出。,表面活性剂处理法,在适当的温度、pH值及低离子强度下，表面活性剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其它蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。

7、,丙酮粉法,丙酮粉法的原理是利用丙酮能使细胞迅速脱水并破坏细胞壁的作用。具体操作：细胞离心 收集菌体 加入冷却的丙酮液 搅拌 抽滤 反复用冷丙酮液洗涤 置干燥器中低温保存。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜部分脂肪，更利于酶的提取。,三、酶的抽提,What？,在酶的分离纯化前期，将经过处理 或破坏的细胞置于一定溶液中，使被 提取的目的酶与其它物质分离的过程， 包括酶与细胞固体残渣的分离、酶与 其他物质的分离。,酶在细胞中结合状态 和溶解程度不同,水溶法,有机溶剂法,（一）水溶法,大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，其中稀盐和缓冲液对酶稳定性好、溶解度大。注意：1. 盐

8、浓度（即离子强度） 2. pH值 3. 温度 4. 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5. 搅拌与氧化,盐浓度,绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。,pH值,蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱应尽量避免，一般控制在pH=68范围内。提取溶剂的pH值应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。,温度,

9、为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质 和酶，提取时一般在05的低温操作。,防止酶的作用,加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度 或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它 们对欲提纯的蛋白质、酶的降解作用。,搅拌与氧化,搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。 因为一般蛋白质都含有相当数量的-SH，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使-SH氧化为二硫键，导致酶活性的丧失。 在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。,（二）有机溶剂法,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水

10、、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂进行提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。,例如：植物种子中的酶70%-80%乙醇提取；动物细胞微粒体、线粒体中存在的酶正丁醇提取，因为正丁醇亲脂性强，可提高酶的溶解度。,分配定律的定义在恒温、恒压和比较稀的浓度下，某一溶质在两个不相混合的液相中的浓度分配比是一个常数，即为下式：（C1/C2）恒温、恒压=KC1表示分配达到平衡后溶质在上层有机相中的浓度C2表示分配达到平衡后溶质在下层水相中的浓度K为分配常数，不同溶质在不同溶剂体系中有不同的K值。,从上式可知，K值越大，则在上层有机

11、相中溶解度越大；反之， K值越小，则在下层水相中溶解度越大。如果混合物中各组分k值彼此接近时，则需要不断更换新的溶剂系统，通过多次抽提便可把各种物质分离。,本章主要内容,第一节 酶的分离纯化程度 第二节 酶的抽提 第三节 酶溶液的浓缩 第四节 酶的分离提取 第五节 酶的纯化 第六节 酶的提纯标准,第三节 酶溶液的浓缩,一、真空薄膜浓缩 二、冷冻干燥技术 三、超滤技术 四、透析技术,一、真空薄膜浓缩,是把酶溶液置于高度真空条件下成为薄层液膜，增大其蒸发面积达到加速蒸发过程的目的。优点： 此法由于在真空条件下，可以大大降低热对酶分子的作用，减少其热变性失活。例如：XJT9503高温中性蛋白酶的制备

12、工艺：采用加热真空薄膜浓缩，在40，-0.094-0.096 MPa真空度下，经过4555min薄膜浓缩，可使发酵处理液浓缩23倍，其酶活力仅损失10%左右。,二、冷冻干燥技术,定义：冷冻干燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得干燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态，且制品复水性极好。 对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。,冻干工艺包括预冻、升华和再干冻三个分阶段。 适用范围：冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及

13、溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。,冷冻干燥技术,冷冻干燥技术,注意事项1.样品溶液： 样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低。 样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。 样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，此时需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。 样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。,2. 装样品溶液的容器最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长。也可以使用安培瓶和青霉素小瓶。冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污

14、染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口。3. 溶液冰冻尽可能用干冰乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。,4.冻干 样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。 样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干。 冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。 关真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。 样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。 真空泵要经常检查油面和油色，通常半年或一季度至少要换一次油。,三、超滤技术,1. 定义：超滤过程是利用膜的筛分机理，

15、在加压条件下，把酶溶液通过一层只允许水分子和小分子物质选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子则被截留，从而达到浓缩酶液的目的。 超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多孔薄膜。,表3-2 “Diaflo” 超滤膜的物理特性,2. 超滤膜的材料醋酸纤维素、各种芳香聚酰胺、聚砜和 聚丙烯腈-聚氯乙烯共聚物。 3. 超滤膜主要形式,折叠平板式、管壳式、螺旋式和中空 纤维管式,四种主要超滤膜 (1) 折叠平板式 (2) 管壳式 (3)螺旋式 (4)中空纤维管式,1. 折叠平板式膜可制成平面滤板，板内形成折叠以增加过滤面积，提高液流的湍动程度，降低浓差极化，此型式装置结构简单，膜面积可达1500m2，易于清洗

16、，易更换，其缺点是过滤面积的扩大会受到限制。2. 管壳式超滤装置是使待处理的酶溶液在管内流动，溶剂及低分子溶质透过管壁汇聚后排出。,3. 螺旋式主要装置是螺旋卷，是将膜、支撑材料、膜、间隔材料依次迭好，围绕一中心管卷紧，形成一个膜组，料液在膜表面通过间隔材料，沿轴向流动，使待处理酶液在管内错流呈螺旋路线。4.中空纤维管式目前常用的是中空纤维超滤膜。内径为0.5-1mm左右，酶溶液从管内流过，溶剂和低分子溶质可透过管壁集中后流出。这种装置过滤面积大，过滤面积高达3000m2/m3。,表3-3 中空纤维超滤装置特性,SIP为旭化成公司产品，使用细胞色素C为标准物；而HF为Amicon公司产品， 使用白蛋白为标准物。,四、透析技术,透析是利用半透膜的选择性在溶液里分离大分子和小分子的一种分离技术。常常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、还原剂之类的小分子杂质。样品在膜的一边，缓冲液在另一边，小分子即向两边扩散直到平衡，而大分子则由于半透膜的阻拦而留在一端，通过不断更换缓冲液，即可将样品中要除掉的小分子稀释到足够低的浓度。,