第十章 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验

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1、,第十章 氨基酸、多肽因子和蛋白质类药品检验,第九章 抗生素类药物分析与生物检定法,基本要求： 掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。,第九章 抗生素类药物分析与生物检定法,基本内容 第一节 氨基酸类药品检验 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 第三节 几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析,第一节 氨基酸类药品检验,氨基酸是

2、治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。 目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物。 如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤 氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征 偶氮丝氨酸治疗白血病 乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎,第一节 氨基酸类药品检验,氨基酸为白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。 氨基酸在等电点（pI）时溶解度最小，最稳定。 中性pI值在56.3左右。 酸性pI值在2.83.2左右。 碱性氨基酸的pI值在7.610.8左右。,第一节 氨基酸类药品检

3、验,一、氨基酸的定性鉴别 旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。 1、化学鉴别法 氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色。 采用茚三酮显色法，中国药典（2010年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。 如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些特定的显色反应。,第一节 氨基酸类药品检验,（1）茚三酮反应 茚三酮在酸性溶液中与-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。,第一节 氨基酸类药品检验,（2）在室温下氨基酸与亚硝酸反应，生成氮气。在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。 注：生成的

4、氮气只有一半来自氨基酸。,第一节 氨基酸类药品检验,（3）,第一节 氨基酸类药品检验,（4）,第一节 氨基酸类药品检验,（5）,第一节 氨基酸类药品检验,（6）,第一节 氨基酸类药品检验,（7）,第一节 氨基酸类药品检验,（8）乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色,第一节 氨基酸类药品检验,（9）组氨酸的侧链咪唑基也能与重氮苯磺酸反应形成与Pauly反应相似的化合物，呈棕红色。,第一节 氨基酸类药品检验,（10）借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。,第一节 氨基酸类药品检验,2、光谱鉴别法 （1）紫外吸收光谱法 在20种天然氨基酸中，只有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在紫外区有最大吸收

5、。 酪氨酸的max275nm 275=1.4x103 苯丙氨酸的max257nm 257=2.0x102 色氨酸的max280nm 280=5.6x103,1：酪氨酸 2：色氨酸 3：苯丙氨酸。,第一节 氨基酸类药品检验,这三种氨基酸可以通过紫外吸收光谱加以鉴别。 精密称取酪氨酸、色氨酸、苯丙氢酸各适量。 用水制成每1mL含20g（色氨酸）、40g（酪氨酸）、200g（苯丙氨酸）。 在波长230300nm测定各氨基酸的吸收光谱，如右图。,第一节 氨基酸类药品检验,（2）红外吸收光谱图 氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据。 用红外分光光度法进行氨基酸鉴别

6、时，除另有规定外，通常固体供试品均采用溴化钾片法，在400667cm-1范围内测定其吸收图谱。 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相互强度关系均应与对照的图谱一致。,第一节 氨基酸类药品检验,3、薄层色谱鉴别法 在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。 （1）薄层板的制备,第一节 氨基酸类药品检验,（2）十一种氨基酸混合液（色、蛋、亮、异亮、甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液的制备。,第一节 氨基酸类药品检验,（3）点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各3L，分别点于同一薄层板上。 以正丁醇-水-异丁酸-醋酸（505057）之上层作展开剂，进行单向三次展开，展开约15c

7、m，每次必须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。 喷以显色剂（吲哚醌1g，溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中）置100干燥510min至显色完全为止。,第一节 氨基酸类药品检验,本层析系统中，由于分离的程度与各种氨基酸显出不同的颜色，可以区别十一种氨基酸。 用茚三酮-硝酸钠试剂亦能显出不同颜色的色斑，且灵敏度较高。 用E.Merck规格微晶纤维素比其他规格的微晶纤维素的分离效果和重现性较好。,第一节 氨基酸类药品检验,（3）点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各3L，分别点于同一薄层板上。 以正丁醇-水-异丁酸-醋酸（505057）之上层作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必须

8、待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。 喷以显色剂（吲哚醌1g，溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中）置100干燥510min至显色完全为止。,第一节 氨基酸类药品检验,二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸。 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶G薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸（311）展开晾干后，喷茚三酮的丙酮溶液显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。,第一节 氨基酸类药品检验,氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解或化学

9、方法裂解大分子蛋白后经层析或超滤等方法得到的小分子物质，因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。 方法：取适宜浓度的样品溶液，加等体积的20磺基水杨酸溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。,第一节 氨基酸类药品检验,2、安全性检查 影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。 采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,第一节 氨基酸类药品检验,三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 当茚三酮在酸性条件下和氨

10、基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的波长为570nm。,第一节 氨基酸类药品检验,茚三酮反应为一切-氨基酸所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。 本法可允许的测定范围是0.550g氨基酸。 该法又分为Yemm法、Rosen法和Hydrindantin法。,第一节 氨基酸类药品检验,（1）Yemm法 取样品1.0mL（含0.020.5mol/L氨基酸），加枸橼酸缓冲液（枸橼酸21g溶于100ml水中，加1.0mol/L氢氧化钠溶液200mL，加水至

11、500mL）0.5mL，茚三酮溶液（茚三酮2.5g溶于50mL甲基溶纤剂中）0.2mL，氰化钾溶液（0.01mol/L氰化钾溶液5mL与25mL甲基溶纤剂混合）1.0mL，充分混匀，沸水浴加热15min，冷却。 加入稀释剂35mL，于570nm波长处测定。 按标准曲线计算出含氨基酸的量。 如所测氨基酸种类不明时，可用亮氨酸作标准曲线。,第一节 氨基酸类药品检验,（2）Rosen法 该法是Yemm法的改良。 取样品1.0mL，加茚三酮溶液（茚三酮3g溶于100mL甲基溶纤剂中）及氰化钠溶液（氰化钠490mg溶于1L水中，取该溶液20mL，加醋酸缓冲液至1L）各0.5mL，充分混匀，沸水浴加热15

12、min，立即加50（V/V）异丙醇，充分搅拌，放冷，比色，计算。 （3）Hydrindantin法 取茚三酮20g及茚烷酮（Hydrindantin）3g溶于750mL甲基溶纤剂及4mol/L醋酸缓冲液（醋酸钠272g溶于适量水中，加冰醋酸50mL，加水至500mL）250mL中，混合作为显色指示剂。取样品12mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。,第一节 氨基酸类药品检验,2、三硝基苯磺酸（TNBS）法 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。 TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物（带有等摩尔 ），如下式。,第一节 氨基酸类药品检验,中间络合物在光谱下有两

13、个吸收值相近的高峰，分别位于355nm和420nm附近。 溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸（TNP氨基酸），420nm处的吸收值显著下降，而350nm附近的吸收峰则移至340nm处。,第一节 氨基酸类药品检验,利用TNBS与氨基酸反应的这一特性，可在420nm处（偏碱性溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。 本法允许的测定范围是0.050.4mol氨基酸。,第一节 氨基酸类药品检验,3、铜复合物紫外吸收法 在合适的pH值条件下，2mol -氨基酸与1mol铜离子形成氨基酸-铜复合物：,第一节 氨基酸类药品检验,此复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在23

14、0nm有最大吸收，其摩尔吸收系数在230nm处为620nm处的100倍左右，因此利用氨基酸-铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定。 本法可允许测定范围是50500mol/mL的氨基酸。 适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。,第一节 氨基酸类药品检验,4、甲醛滴定法 氨基酸的NH3+基的pK值常在9.0以上，不能用一般指示剂作酸碱滴定测定。 但甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，促使NH3+上的氢离子释放。,第一节 氨基酸类药品检验,在pH值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。即可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴

15、定。 每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮，从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及氨基酸含量。,第一节 氨基酸类药品检验,5、非水溶液滴定法 中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法。 用冰醋酸作溶剂，高氯酸作标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。 适用于常量氨基酸的含量测定。,第一节 氨基酸类药品检验,第一节 氨基酸类药品检验,（1）直接滴定法 适用于能溶于冰醋酸的氨基酸。 精密称定氨基酸样品约50mg，溶于20ml冰醋酸中，加2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。 终点为紫色消失，呈现蓝色，计算，即得。 用直接法测定的氨基酸有丙氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等。 谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解，可将样品溶于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用标准高氯酸溶液滴定。,第一节 氨基酸类药品检验,（2）回滴法 适用于不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。 精密称定氨基酸样品约30-40mg，溶于5mL高氯酸标准液中，加2滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余的酸，颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为终点，计算，即得。 用回滴法测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。,第一节 氨基酸类药品检验,