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1、第二军医大学博士学位论文人脐带间充质干细胞向造血细胞方向分化的研究姓名：胡凯猛申请学位级别：博士专业：基础医学；人体解剖与组织胚胎学指导教师：刘厚奇201206人脐带问充质干细胞向造血方向分化的研究摘要从世界完成首例造血干细胞移植到现在已经有5 0 年的时间了，这项技术已经成为治疗各类恶性血液病的最为有效的方法，每年全球移植病例数都在增加，接受这项技术治疗的患者最长的无病生存时间已经超过3 5 年了。造血干细胞的成功植入是H S C T 发挥治疗作用的前提，在临床治疗中于宿主H L A 不全相合、输注造血干细胞数量不足、移植前大剂量化疗致骨髓基质损伤严重及移植物抗宿主病发生均会导致造血于细胞植
2、入失败或植入延迟，从而使移植死亡率增加，使得该技术在实际应用中面临着很大困难。特别是在一些恶性血液病的治疗中，由于长期、多次的输入异体来源的H S C ，极易引发致死性的肺损伤以及移植后感染。因此，解决H S C T 中的H S C 的来源以及其安全问题，获得稳定、高效的造血干细胞或具有造血潜能的细胞成为进一步推广H S C T 的关键，这不仅具有重要的医学意义，而且将产生巨大的社会经济效益。以往的观点认为，未分化细胞分化形成特定类型的终末细胞这一过程是不可逆的；但近几年发育生物和干细胞技术的发展可以成功的将一种类型的组织特异性细胞转化形成另外一种类型的细胞。在H S C T 的病人中也支持了
3、这些观点。H S C T 数月后，可以在病人的骨髓或者造血组织中发现来源于宿主的表皮细胞、肝细胞，甚至还出现了消化管上皮细胞等。这些结果表明在体内环境中的人体干细胞在分化过程中存在着一定的不确定性。而现在的表观遗传学研究也为终末细胞之间的互相转化提供了可能。也有实验表明可以讲表皮细胞或者其他细胞诱导成为造血系细胞。如果这些研究成果能够成熟并且得以应用，将解决上面提到的H S C T 中出现的问题。间充质细胞是容易得到的较为幼稚的一类干细胞，而且具有多向分化潜能，可以在体外容易大量增殖，如果可以将间充质细胞成功诱导形成造血细胞，探明转化的机制，将具有广阔的应用前景。本课题拟以人脐带间充质干细胞为
4、诱导前体细胞，采用贴壁法和酶消化法获得原代细胞，纯化后再分选出较为均一的有多系分化潜能的多能干细胞群，经过化学诱导的方法，改变其表观遗传学表达，对诱导后细胞进行形态、免疫学和造血功能等方面的检测，探讨其向造血细胞方向分化的可行性。迸一步研究细胞分化过程中M i R N A 的表达变化，分析诱导后细胞内表观遗传学变化的方式和方法。与成体来源，如骨髓间充质干细胞相比，h U M S C s 的幼稚程度更低，H L A 抗原表达更弱，其扩增和多向分化能力也较强；与H S C 相比，两者都属于来源于胚外中胚层的间充质组织，所以从理论上具有转化的可能。以往在H S C T 中M S C 一直作为辅助使用
5、细胞，但是如果能够稳定的将M S C 诱导形成H S C ，将解决H S C T 中存在的来源不稳定和异体移植的问题，在临床上发挥不可估量的作用。第二军医大学博士学位论文第一部分：人U M S C s 的分离培养与鉴定方法：( 1 ) 分别采用贴块法和酶消化法获得原代培养的h U M S C s ，传代纯化后进行克隆化培养，培育出形态和增殖能力较为单一的细胞克隆。( 2 ) 光镜及电镜观察h U M S C s 克隆化后的形态学特点。( 3 ) 取第4 代( P 4 ) 的h U M S C s 进行免疫细胞荧光化学染色和流式细胞仪检测间充质干细胞的标志性分子：V i m e n t i n
6、、a S M A 、O c t 4 、S o x 2 、H L A 1 、C D 2 9 、C D 3 4 、C D l 3 3 、C D 4 4 和C D 4 5 。( 4 ) 取P 4h U M S C s 进行流式细胞仪检测细胞周期D N A 含量。( 5 ) 对克隆化h U M S C s 进行体外细胞诱导分化，鉴定其脂肪与成骨细胞方向分化的潜能。结果：原代培养7 d 后可见培养瓶中有克隆样生长的细胞团，经过单一细胞的克隆化传代培养后：( 1 ) 形态上呈梭形或纺锤形，胞浆丰富；透射电镜显示，克隆化P 4 h U M S C s 细胞核内异染色质较少，核仁明显。( 2 )表面标志分子上
7、，免疫荧光细胞化学检测显示，P 4h U M S C s 均表达间质细胞骨架蛋白V i m e n t i n 、早期平滑肌细胞表面标志物a S M A 、全能性转录因子O c t 4 和S o x 2 、间充质干细胞表面抗原C D 2 9 和C D 4 4 、其中2 3 的细胞表达C D l 3 3 、5 细胞表达H L A 1 、) 。5 的细胞表达C D 3 4 和C D 4 4 。( 3 ) 细胞周期分析上，h U M S C s8 5 以上细胞是处于静止期，即G O G 1 期，S + G 2 + M 的细胞平均约占1 3 ，符合干细胞细胞周期的特点。( 4 ) 单个细胞来源的P 4
8、h U M S C s 在体外具有向骨细胞和脂肪细胞等终末细胞分化的潜能。结论：( 1 ) 我们所获得的h U M S C s 具备了间充质干细胞的大部分标记，而且C D l 3 3 阳性率较高表明其中相对幼稚细胞数量较多，H L A 1 阳性率较低表明源于脐带组织的干细胞其免疫标记较弱，更适用于干细胞移植过程。( 2 )h U M S C s 可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，表明其具有多向分化的潜能。第二部分：化学诱导h U M S C s 向造血细胞方向分化方法：( 1 ) h U M S C s 向造血细胞方向体外分化诱导模型的建立：设立5 - A z a 与造血生长因子G F 共同诱导为
9、实验组，G F 诱导和为诱导组为对照组。实验用基本培养基为甲基纤维素化培养基，诱导浓度设定在2 5ug m l5 - A z a ，5 0 n g m lG M C S F 和S C F ，设定诱导后1 d 、3 d 、5 d 、7 d 和1 0 d 的不同观测时间，尽可能提高C D 3 4 的阳性细胞比例。( 2 ) 对诱导后细胞进行表面标记的检测t 显微镜观察诱导后细胞形态以及超微形态结构的改变；流式细胞仪检测表面标记分子，包括C D 3 4 、C D 4 5 、C D l 3 3 、C D l l b 、C D 4 4 和C D 2 9 ；免疫荧光检测细胞形态改变时细胞表达H o x b
10、 4 与V i m i n t i n的情况；P C R 反应检测细胞内造血相关信号分子H o x b 4 、S c l 1 、W n t 3 a 和G a t a 2 。( 3 )对诱导后细胞进行造血功能的检测：利用经典脾集落实验，将诱导后的h U M S C s 注射进入接收致死剂量照射的裸鼠体内，1 5 d 后检测裸鼠的血常规、脾脏切片。结果：人脐带间充质干细胞向造血方向分化的研究( 1 ) 随着诱导时间延长，5 - A z a G F 联合诱导组中细胞悬浮于培养基中，呈现出集落样生长的形态。透射电镜观察，细胞内细胞器数量减少，细胞形态核质比进一步增大，核内染色质分布与造血细胞类似。(
11、2 ) 细胞表面标记检测：C D 3 4 、C D 4 5 和C D l 3 3细胞阳性比例随着诱导时间延长而逐渐升高，C D 2 9 和C D 4 4 却逐渐下降。对诱导5 d后的细胞铺片进行免疫荧光检测，其中部分形态变圆的细胞核内已经高表达H o x b 4 ，而仍为梭形的细胞其胞质内仍表达V i m i n t i n 同时，P C R 检测造血信号表达可见H o x b 4 、S c l 1 、W n t 3 a 和G a t a 2 的表达均随着诱导天数的增加而增加。( 3 ) 造血功能检测：脾集落实验后，采集小鼠外周血，血常规分析接种5 - A z a G F 联合诱导细胞组中的粒
12、细胞升高较为明显，有统计学意义；通过对小鼠脾脏切片染色分析，可见组织中有大量细胞表达H L A 1 。结论：经过5 - A z a G F 联合诱导后的h U M S C s ，在形态上已经不具备了间充质细胞的形态特点，逐渐与成体H S C 类似，在表面分子标记上，已经有很大一部分比例细胞开始表达造血干细胞的特异性分子C D 3 4 与C D 4 5 ，而且更为原始的细胞标记C D l 3 3 也有所上升，细胞形态发生改变后，参与造血过程的胞内重要信号分子H o x b 4 表达大大增多，而且通过脾集落实验也可以证明诱导后的h U M S C s 在体内具备了造血重建的功能。可见，在5 - A
13、 z a G F 联合诱导作用下，h U M S C s 可以朝向造血细胞方向分化，具备了造血细胞形态特征和功能特点。第三部分：h U M S C s 向造血细胞方向分化过程中相关M i R N A 的变化方法：( 1 ) 根据M i R N A 文库预测以及相关文献报道，挑选了m i R - 1 2 6 、m i R - 4 5 1 、m i R 1 8 1 a 、m i R 1 5 0 和m i R 2 1 8 为主要研究对象，利用p r i m e r 6 0 生物学软件设计以上5条R N A 的逆转录和R e a l t i m e P C R 弓l 物。( 2 ) 收集5 A z a
14、 G F 联合诱导3 d 、7 d 和1 0 d 的h U M S C s ，以单独G F 诱导为实验对照，以H S C 和h U M S C s 为阳性和阴性对照，R N A 抽提试剂T r i z o l 裂解收集的细胞抽提R N A 。M M L V 逆转录酶的作用下行逆转录反应，s y b e r G R E E N 系统的r e a l t i m e P C R 反应，检测不同时间点相关M i R N A 的差异。( 3 ) 挑选表达差异较大的M i R N A ，体外合成相关M i R N A 片段，脂质体将其转染进入培养的h U M S C s 中，2 4 h 后R e a l
15、 t i m eP C R 检测其表达量的变化，利用甲基纤维素化培养基培养细胞，1 w 后收集转染细胞，W e s t e r n b l o t 检测造血相关因子H o x b 4 的表达，验证该M i R N A 在造血分化过程中的作用。结果：( 1 ) R e a l t i m e P C R 反应检测m i R - 1 2 6 、m i R - 4 5 1 、m i R 1 8 l a 、m i R 1 5 0 和m i R 2 1 8 等M i R N A ，在诱导后的h U M S C s 内表达均有所增加，而且随时问增加表达量进一步增加，其中以m i R - 2 1 8 和m
16、i R 4 5 1 增加较为显著。( 2 )选取m i R 2 1 8 验证其下游功能，将m i R 2 1 8 转染进入h U M S C s 细胞内，2 4 h 后细胞内m i R 2 1 8 表达升高，证明转染有效。1 w 后细胞内造血相关因子H o x B 4 的表达量进一步升高。结论：h U M S C s 向造血细胞方向分化过程中m i R 1 2 6 、m i R 一4 5 l 、m i R - 1 8 1 a 、第二军医大学博士学位论文m i R 1 5 0 和m i R 2 1 8 表达量均增高，其中m i R 2 1 8 对造血功能启动具有一定意义。研究结论和意义1 应用化学诱导的手段进行重编程以获得专能干细胞。应用化学诱导的方法，设定多个浓度和参考条件，为获得稳定的造血细胞提供了更加可能的条件。2 从表观遗传学角度探明间充质类细胞向造血细胞方向的机制。由于采用了改变细胞表观遗传学的方法诱导，所以可直接关注到M i I 斟A 的变化，为研究细胞转化过程的决定因素的探讨提供了理论依据
