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1、重组人神经型一氧化氮合酶 催化阿霉素单电子还原的研究,导 师：赵迎社 副教授 井柳尧 教授(日本) 研究生：付 捷 专 业：生物化学与分子生物学,硕士学位毕业论文答辩,研究背景,1，人类神经型一氧化氮合酶的结构和功能特征；2，醌类药物阿霉素的心肌毒性与一氧化氮合酶催化的单电子还原有关。,哺乳动物体内的一氧化氮 （NO） 和一氧化氮合酶 （NOS）,L-精氨酸 + O2,一氧化氮合酶（NOS）,NADPH,瓜氨酸 + NO,神经冲动传导,血压调节,免疫应答,同工酶,神经型NOS (nNOS),内皮型 NOS (eNOS),诱导型 NOS (iNOS),表达方式,主要调节方式,组成型表达,组成型表
2、达,诱导型表达,钙离子浓度,磷酸化,诱导因子,分子量,160 kD,130 kD,135 kD,人神经型一氧化氮合酶 (hnNOS) 的结构,FMN,FAD,NADPH,N,C,精氨酸结合位点,蝶呤结合位点,Heme 结合位点,CaM 结合位点,还原酶结构域,氧化酶结构域,Cit + NO.,Arg + O2,Heme,FMN,FAD,NADPH,2e-,e-,e-,hnNOS 中的电子传递,FAD,FMN,FAD,FMNH.,FADH.,FMNH.,FAD,FMNH2,FADH.,FMNH2,FADH2,FMNH.,FADH2,FMNH2,完全氧化态,单电子还原态,双电子还原态,三电子还原态
3、,完全还原态,1，FMNH2是电子传递过程中的主要活性形式；2，空气稳定半醌 (FAD-FMNH.) 是该黄素对在体外有氧条件下的稳定存在形式；3，钙离子/钙调蛋白结合能促进分子内电子传递。,醌类药物的致病机制,氧化损伤,O,O,HO,HO,O,OH,OH,O,O,NH2,OH,Me,MeO,(adriamycin),NADPH,HO,O,HO,HO,O,OH,OH,O,O,NH2,OH,Me,MeO,(adriamycin-H.),O2,阿霉素 醌类药物,阿霉素半醌,O2.-,e.-,一氧化氮合酶,研究目的,1,构建重组人神经型一氧化氮合酶的表达系;2,阐明人类神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单
4、电子还原的机制。,技术路线及实验方法,构建 hnNOS 在大肠杆菌中的表达系,表达和纯化一氧化氮合酶,酶的表达和性质鉴定,分子克隆，原核表达系,阴离子交换层析和亲和层析,SDS-PAGE, Western Blot, 毛细管区带电泳, 光谱法,表观代谢常数的测量,单电子受体特征波长吸光度的改变速度,钙离子浓度的作用,不同浓度钙离子条件下NADPH在340 nm处吸光度的改变速度。,阿霉素与氧自由基的生成,氧化型血红蛋白在 576 nm 吸光度的改变速度,hnNOSs 在阿霉素还原反应中的作用,630 nm 附近吸光度改变，反映黄素半醌的 形成,技术路线,实验方法,实 验 结 果,重组人神经型一
5、氧化氮合酶的表达系构建，表达，纯化与性质鉴定。,第一部分,构建 hnNOS 的原核表达系,pBluscript SK I (-),hnNOS cDNA,PCR (Nde I/Xba I),pCWori+,Nde I,Xba I,连接,转染 E.coli,蛋白表达鉴定,阳性克隆（Ampr）,Nde I/Xba I 酶切,重组质粒鉴定,分子克隆产物鉴定（1）,1 2 M,5.8 kb,3.5 kb,1、2： 酶切产物； M：分子量 Marker.,2，重组质粒酶切（Sma I）鉴定。,4.3 kb,6.2 kb,3.5 kb,1 2 M,1、2： PCR 产物； M：分子量 Marker.,1，P
6、CR 产物鉴定,1% 琼脂糖凝胶电泳,1% 琼脂糖凝胶电泳,6.2 kb,3.5 kb,分子克隆产物鉴定（2）,C,3，DNA 测序结果. 发现C (3668) T，其编码的脯氨酸（Pro）没有改变。,1,2,3,1，细胞； 2，离心后上清； 3，离心后沉淀,4，蛋白质Western Blot 鉴定。使用兔抗鼠神经型一氧化氮合酶 FMN 结合结构域。,纯化 hnNOS,2YT, Amp 50 mg/ml, 30,+ IPTG,+ d-ALA,集菌,超声碎菌, 离心分离,DE52 阴离子交换层析纯化,2, 5-ADP Sepharose 4B 亲和层析纯化,蛋白洗脱,浓缩,缓冲液 A: 50 m
7、M Hepes, pH 7.0, 10 mM EDTA, 5% Glycerol, 0.2 mM PMSF,M,hnNOS,158 kD,175 kD,83 kD,8% SDS-PAGE,FAD:FMN = 1:0.96,NO 生成：- CaM, 0 min-1;+ CaM, 21.4 1.2 min-1.,hnNOS 全长的光学特性 （1）,2.0,1.0,0,300,400,600,800,波长 (nm),吸光度,400 nm,450 nm,475 nm,650 nm,Heme absorption,Flavin absorption,0.2,0.1,0,300,400,600,800,波
8、长 (nm),a: Oxide form of hnNOS,b: + 5 fold NADPH,c: 20 min later,596 nm,475 nm,a,b,c,550 nm,hnNOS 全长的光学特性（2）,350,500,- 0.01,0,0.01,420 nm,380 nm,300,400,600,800,0,0.2,0.4,吸光度,400 nm,395 nm,hnNOS,L-Arg perturbation,波长（nm）,精氨酸结合 Ks = 2.7 mM,精氨酸结合差值吸收谱,吸光度,波长（nm）,hnNOS 还原电子受体反应的表观动力学常数,电子受体,Km (mM),- Ca
9、M,+ CaM,铁氰化钾,细胞色素 c,NADPH*,1227 95,898 72,7.1 1.3,5.0 1.0,0.88 0.12,0.44 0.14,*NADPH was used as an electron donor.,NADPH,FAD,FMN,Heme,铁氰化钾,细胞色素 c,CaM,2e-,1e-,1e-,1e-,1e-,kcat (min-1),- CaM,+ CaM,4108 170,13900 588,144 19,2831 359,Activation fold,3.4,20,小结,1，用于细胞色素P450还原酶的原核表达系同样适用于人神经型一氧化氮合酶全长酶；2，重
10、组人神经型一氧化氮合酶与鼠神经型一氧化氮合酶的性质相似。,第二部分,重组人神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的研究,纯化 hnNOS FAD/NADPH, FAD/FMN 结合结构域，辅酶钙调蛋白(CaM),2,3,M,1,1, FAD/FMN 结合结构域; 2, FAD/NADPH 结合结构域; 3, 辅酶 CaM.,80 kD,49 kD,17 kD,12% SDS-PAGE,hnNOSs 还原醌类药物反应的表观动力学常数,电子受体,kcat (min-1),Km (mM),- CaM,+ CaM,- CaM,+ CaM,阿霉素,甲萘醌,丝裂霉素 c,FAD/NADPH结合结构域,FA
11、D/FMN 结合结构域,全长酶,50 4,12 2,78 6,21 3,43 10,41 9,10 1,10 1,14 2,11 1,28 5,15 3,55 9,7.3 0.3,13 1,294 14,288 14,5620 226,318 19,5729 615,478 57,565 16,5220 176,393 24,5662 229,38 3,121 8,1477 146,37 0.4,851 25,Ca2+/CaM 结合可促进 hnNOS FAD/FMN 结合结构域，和 全长酶对醌类药物的还原作用约20倍。,阿霉素,甲萘醌,丝裂霉素 c,1，hnNOS 的氧化酶结构域对催化醌类药物
12、的单电子还原作用没有明显影响；2, 在 Ca2+/CaM 存在的条件下，FMN 是FAD/FMN 结合结构域和全长酶还原醌类药物的主要电子供体。,NADPH,FAD,FMN,Heme,CaM,2e-,1e-,1e-,1e-,1e-,醌类药物,Ca2+/CaM 的结合作用,A：全长酶,B: FAD/FMN 结合结构域,- CaM,+ CaM,1，酶还原反应的加速作用与钙离子浓度呈正相关； 2，酶与钙离子/钙调蛋白结合步骤不是反应的限速步骤。,340 nm,阿霉素与过氧化物,MD.- (- 210 mV) + O2,MD + O2 .- (-155 mV),Adr.- (- 292 mV) + O
13、2,Adr + O2 .- ( -155 mV),2O2.- + 2H+,H2O2 + O2,SOD,NADPH,hnNOS,甲萘醌 MD / 阿霉素 Adr,MD.-/ Adr.-,Hb+,Hb,O2,O2.-,H2O2 + O2,O2,Hb-O2,动态平衡反应,MD / Adr,(1),(2),(3),SOD,SOD 对 hnNOSs 氧化血红蛋白生成的作用,0,50,100,150,0,5,10,15,20,25,hnNOS 全长酶,25,20,15,10,5,0,hnNOS FAD/FMN 结合结构域,0,50,100,150,氧化型血红蛋白生成速度 ( mM/min),超氧化物岐化酶
14、 (nM),+ Ca2+/CaM, + 甲萘醌,- Ca2+/CaM, + 甲萘醌,+ Ca2+/CaM, + 阿霉素,1，O2.- 是反应的活性中间产物； 2，阿霉素半醌较甲萘醌半醌易生成氧自由基。,hnNOS FAD结合结构域对阿霉素的还原作用,0,10,20,30,40,50,DA = 0.01,C,630 nm,DA = 0.02,0,0.05,0.1,0.15,0.2,630 nm,B,时间 (sec),吸光度,560,750,620,680,0.08,0.06,0.04,0.02,0,a,d,a: 16 ms;,b: 40 ms;,c: 88 ms;,d: 184 ms.,A,光谱测定,FAD 结合结构域,NADPH + 阿霉素,混合,波长 (nm),FADH2 的还原活性高于FADH.,hnNOS FAD/FMN 结合结构域对阿霉素的还原作用,DA = 0.02,- CaM,630 nm,DA = 0.02,0,50,100,150,200,+ CaM,630 nm,时间 (msec),560,750,620,680,a,d,a: 16 ms;,b: 40 ms;,c: 88 ms;,d: 184 ms.,+ CaM,
