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1、细菌耐药机制及检测,一、细菌耐药的遗传机制细菌耐药性的遗传学机制主要指细菌的耐药性通过基因突变(即染色体介导的耐药性)获得，或通过质粒或转座子水平传播获得外源耐药性基因，也可通过整合子捕获外源基因使之转变为功能性基因来传播耐药性。,1、染色体介导的耐药 2、质粒介导的耐药 3、整合子介导的耐药,二、细菌耐药的化学机制 （一）产生灭活抗生素的各种酶(二 ) 膜通透性下降 （三）抗菌药物作用靶位改变 （四）细菌主动药物外排机制 （五）细菌生物被膜的形成,几种常见的可灭活抗生素的酶 1、-内酰胺酶(-lactamase) （1）超广谱-内酰胺酶(Extended-Spectrum-lactamase
2、s,ESBLs) （2）头孢菌素酶（AmpC酶） （3）碳青霉烯酶 （4）金属酶 2、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶 3、MSL类钝化酶 4、氯霉素钝化酶,三、当前主要的耐药性问题 革兰阳性菌：耐青霉素肺炎链球菌（Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP）；耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococci,MRS）；耐万古霉素肠球菌（Vancomycin resistant enterococcus,VRE）及耐万古霉素金黄色葡萄球菌（Vancomycin resistant S.aureus,VR
3、SA）。 革兰阴性菌：产超广谱-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌(ESBLs)；持续高产型-内酰胺酶的阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等；多重耐药的铜绿假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽窄假单胞菌。 对异烟肼和利福平耐药的多重耐药结核分枝杆菌（Multidrug resistance Mycobacteria tuberculosis,MDR-Tb）。,四、主要的耐药性检测方法 （一）耐青霉素G的肺炎链球菌（PRSP） 筛选试验：1g/片苯唑青霉素，MH琼脂+5%羊血，35含5%CO2%环境中孵育20-24小时，抑菌环直径19mm耐药，20mm敏感；确证试验：稀释法测定青霉素MIC，MIC0.06g/ml敏感
4、 2g/ml耐药。,（二）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS） （1）纸片筛选法：含4%NaCl的MH琼脂，30g/片头孢西丁，33-35，24小时。对于金黄色葡萄球菌，抑菌环直径19mm，为MRSA，抑菌环直径20mm，为MSSA；对于凝固酶阴性葡萄球菌，抑菌环直径24mm，为MRCONS，抑菌环直径25mm，为MSCONS。 （2）琼脂筛选法：MH琼脂中加入6ug/ml苯唑西林、4%氯化钠，直接菌落悬液法，涂布接种，35，孵育至24小时。任何有生长的现象均为MRS。 （3）乳胶凝集或基因扩增法直接检测MecA基因。,（三）万古霉素中介或耐药的葡萄球菌，VIS或VRS 筛选方法：MH琼脂，万古霉素
5、（30g/片），抑菌环直径14mm应测MIC；肉汤稀释法MIC816g/ml为VIS，MIC32g/ml为VRS。任何耐万古霉素的葡萄球菌均应送参考实验室进一步检测。,（四）耐万古霉素的肠球菌检测方法：30g/片万古霉素，抑菌环14mm为耐万古霉素肠球菌。,（五）超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases ESBLs） （1）药敏推测法：根据ESBLs能水解三代头孢的原理进行检测。用标准琼脂扩散法测定头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢泊肟和头孢曲松的抑菌环直径，按NCCLS标准进行判断。凡头孢他啶抑菌环直径22mm、头孢泊肟抑菌环直径17mm、氨曲南或头孢噻肟抑菌
6、环直径27mm、头孢曲松抑菌环直径25mm，任何一种药物抑菌环直径达到上述标准，或用稀释法检测上述药物的MIC大于等于2ug/ml,均疑为ESBLs菌株。应进一步作确证试验确诊。 （2）表型确证试验：根据ESBLs可被克拉维酸抑制的原理，按NCCLS推荐的指南进行操作，包括纸片法和稀释法。前者采用头孢他啶(30g)及头孢他啶/克拉维酸(30g/10g)组合，头孢噻肟(30g)及头孢噻肟/克拉维酸(30g/10g)组合，任一组药物的抑菌环的直径差5 mm时，判定为ESBLs阳性株。,（3）双纸片协同法：根据ESBLs可水解三代头孢，有可被克拉维酸抑制的原理，将阿莫西林/克拉维酸抑制纸片置于头孢他
7、啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南中间，使两纸片中心间距为2030mm，如果在阿莫西林/克拉维酸与任何一种纸片间出现协同抑菌现象,视为产ESBLs株。此法操作简便，特异性、灵敏度菌较好，可作为检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产ESBLs的常规方法。 （4）头孢曲松三维试验：根据ESBLs可水解三代头孢，但不被氯唑西林抑制的特点，按标准纸片扩散法操作，取相当于0.5麦氏浊度的标准大肠埃希菌ATCC25922菌液，接种M-H琼脂平板，平板中心贴一30ug头孢曲松纸片，再距头孢曲松纸片5mm处分两个方向划两条长约15mm的狭缝，其中一条加40ul酶提取液，另一条加36ul酶提取液和4ul2*10000umo
8、l氯唑西林，35过夜，若单加酶提取液的狭缝和加酶提取液和氟氯西林的狭缝与抑菌圈交接处均出现扩大生长区域，视为ESBLs三维试验阳性。此法利用酶的粗提物检测，又用氯唑西林抑制，消除了其他酶存在对检测结果的影响，尤其适用于大肠埃希菌和克雷伯菌以外的革兰阴性杆菌ESBLs的检测。,（5）等电聚焦及克拉维酸抑制试验：将临床分离菌中粗提的未知ESBLs进行等电聚焦电泳，,测定其等电点(PI),与已知酶的ESBLs的PI进行比较,又根据克拉维酸可以抑制的ESBLs活性，而对其他-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。可先用克拉维酸对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，可进行ESBLs的检测和分
9、型。 （6）产酶基因的检测：提取待测菌的DNA作为扩增模板,采用已知标准酶基因的特异性引物,进行体外循环扩增,结果如为阳性说明有已知ESBLs的产酶基因。还可对扩增产物进行测序，确定ESBLs的类型。,（六）型-內酰胺酶（AmpC酶） （1）头孢西丁敏感实验：根据AmpC酶可以水解头孢西丁（FOX），而ESBLs等其他-内酰胺酶一般不能分解头孢西丁这一特性，可以对AmpC酶的菌株进行初步筛选。具体操作方法：（1）纸片扩散法：按美国临床实验室标准委员会（NCCLS）的纸片扩散（K-B）法进行。FOX纸片的含量为30ug。判断标准为抑菌环18mm,表示待检菌株对FOX耐药。（2）稀释法：参照NCC
10、LS的方法进行，判断标准为MIC16ug/ml，表示待检菌株对FOX耐药。对FOX耐药的菌株，应怀疑产AmpC酶的可能。此方法仅作为初步筛选。需做三维试验或纸片协同试验等进一步的确定。,（2）AmpC酶表型筛选试验：根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性，对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。选用亚胺培南（IP）、头孢吡肟（FEP）、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/Cla）、头孢噻肟（CTX）和头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Cla）5种抗菌药物纸片，按NCCLS的K-B法进行操作。判断方法：（1）IP、FEP敏感，而CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla耐药；（2）IP、FEP敏感
11、，而在CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla的抑菌环内存在散在的菌落；（3）IP敏感，而FEP、CAZ/Cla和CTX/Cla耐药。以上三种结果提示，待检菌株产AmpC酶。最后一种表型提示，待检菌株产AmpC酶的同时，产生其他-内酰胺酶，如产ESBLs。此方法操作简便、快速省时，较三维实验简单得多，可作为产AmpC酶菌株的筛选试验。,（3）氯唑西林（CLO）双抑制剂扩散协同实验：根据氟氯西林（CLO）可抑制AmpC酶的特性进行检测，按NCCLS的K-B法操作，在M-H平板上均匀涂布待检菌株，中央贴一空白纸片，并在其周围2025mm处贴上头孢他啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢哌酮（CFP）
12、、氨曲南（ATM）和头孢噻肟（CTX）纸片，再在空白纸片上滴加10mg/mlCLO20ul,35。C孵育1824h,观察纸片之间的抑菌环情况，CLO与任何一种头孢菌素协同为阳性，提示产AmpC酶。因CLO在琼脂中的扩散能力较差，故将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散，效果较好。此方法操作简便、快速省时。结果基本可靠，可以在各临床微生物实验室推广应用。,（4）酶提取液三维试验：利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理操作。制备-内酰胺酶粗提物：将待检菌株接种在M-H肉汤或胰蛋白大豆胨水增菌，离心收集细菌，用0.01mol/l的磷酸盐缓冲液或PBS（PH7.0）冲洗后制成一定浓度的细菌悬液，再用冻融
13、法（-70快速冷冻、室温或37水浴快速解冻，反复5次）或超声粉碎法（4超声粉碎）破碎菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，再离心（12.000r/min,1h）去除细菌碎片，收集上清液即为-内酰胺酶粗提物。三维试验：将大肠埃希菌标准菌株ATCC25922按NCCLS的K-B法涂布在M-H平板上，在平板的中央贴一张FOX纸片，从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平板可切45条裂隙），每一裂隙中加入2530ul的一种待检菌株的-内酰胺酶粗提物35培养1824 h，观察结果。裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为AmpC酶阳性。因利用酶的粗
14、提物而不是活菌做检测，不受抗菌药物的诱导的影响，故三维试验是目前公认的、较为经典的 检测（去阻遏）持续高产AmpC酶的方法，也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法。但缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。,（5）等电聚焦及氟氯西林抑制试验：一般的AmpC酶的等电点（PI）偏碱，且大多大于等于9.0，故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来，制成酶粗提物，再用等电聚焦的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他 -内酰胺酶或其他蛋白成份分开。又根据氟氯西林可以抑制AmpC酶的活性，而对其他-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进
15、行抑制，再用头孢硝噻吩进行显色反应，被抑制掉的条带即可能为AmpC酶条带。 具体操作方法：用超声粉碎法制备待检细菌中的-内酰胺酶粗提物，再对待测-内酰胺酶进行等电聚焦（用两份同种-内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板，电泳的条件完全相同）。在一块凝胶板（A）上覆盖浸有氟氯西林（1mmol/L）的滤纸条，另一块凝胶板（B）上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条，30s后去除两块凝胶板上的滤纸，再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩（500ug/ml）的滤纸条，1min后揭去滤纸条，观察结果。如果A、B两块凝胶板上的条带颜色不同，即在B板上变色（有黄变红者）、而在A板上不变色（仍为黄色）的条带，即为AmpC酶阳性。与三维试
16、验相同，该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌做检测，不受抗菌药物的诱导影响，还可确定AmpC酶的型别。但缺点较三维试验更繁琐、费时，不宜在临床微生物实验室推广应用。,（6）AmpC酶的基因检测：AmpC酶的基因组是由一种结构基因ampC和四种调控基因ampR,ampD,ampE,ampG组成，AmpC酶基因存在于阴沟肠杆菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产AmpC酶的细菌的染色体远端或质粒中。存在于不同细菌中的AmpC酶基因其特定的核苷酸序列都是相同的，即不论是结构基因ampC还是各种调控基因，都有其特定的核苷酸序列。故通过查找待检细菌中有无特定的AmpC酶的基因片段（通过特异性的基因引物，扩增待检细菌中特定的AmpC酶的基因片段，分析其特定的核苷酸序列），即可确定待检细菌能否产AmpC酶。如将PCR产物测序，并与标准序列相比较，还可检测AmpC酶的型别。AmpC酶的基因检测法可直接检测待检细菌中染色体或质粒上的ampC基因或ampD基因片段，不受表型和外界因素的影响，准确性高。但该方法的实验操作仍较繁琐，不适合于临床常规应用。,
