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1、2018年10月22日星期一,新型十六元大环内酯化合物杀虫活性及机理,博 士 生：张绍勇指导教师：张立钦教授森保课题组,浙江农林大学 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室,浙江农林大学2013博士开题报告,2018年10月22日星期一,汇报内容,立题依据 研究目标及内容 研究方法及试验方案 预期进展及成果 工作基础,1.选题依据及意义,浙江省是全国重点产竹省份，竹林面积约占全国的六分之一。全省竹林面积为 81.93 万 hm2，占森林面积的13.8%。国家林业局统计数据显示， 2012年，中国竹业总产值达195亿美元，从业人员达到775万人 。2011年，浙江省竹产业总产值实现300亿元
2、，近40个县（市、区）的竹业产值超过亿元。 浙江省竹产业产品品种丰富，应用领域不断拓展，涉及建筑、家具、造纸、 包装、运输、食品、 医药、保健、纺织、旅游、环保等行业，成为从资源培育到加工利用和出口贸易的新兴朝阳行业。,1.选题依据及意义,竹林的经营培育已告别传统方式， 向规模化、 集约化、 现代化方向发展。 目前中国竹产业存在的问题主要在产量向产值的转换和病虫害防治方面，傅懋毅说。当下竹产业要突破的一个方向，是在保证生态保护的前提下实现高产竹类作物推广。当前全国范围内，高产竹只占种植面积的10。 气候因素？纯林潜在威胁。,竹笋残留,竹农为了生产效益， 广泛使用高度农药，如敌敌畏，毒死蜱等，造
3、成高残留的同时，杀死害虫天敌，造成生态环境的破坏。 尚未有正式林药登记。,1.选题依据及意义,防治难题： 1）缺乏安全有效防治方法，又不敢使用农药，造成严重减产； 2）乱用药，造成农药残留，危害食品安全，严重影响价格、出口和生产前景，对产业的持续发展形成了严重威胁。 3）天维菌素保留了十六元内酯环的主体结构和C13位二糖基，其螺缩酮基团和米尔贝霉素相同。国内外文献未见报道，是一种新的十六元大环内酯类化合物。对鳞翅目、鞘翅目幼虫、线虫、螨虫具有较好的生物活性。,1.选题依据及意义,本论文将在十六元环内酯化合物5、13位等碳原子上，应用化学合成、生物合成等手段，构建结构新颖、多样的十六元环内酯衍生
4、物，以供试生物为供试生物，系统测定各化合物的杀虫活性；克隆供试生物的谷氨酸配体门控氯离子通道（GluCl）基因，将其转入COS-7细胞，采用全细胞膜片钳技术，研究十六元环内酯衍生物对供试生物GluCl的激活能力（IC50）。以化合物的结构参数、杀螨活性LC50及LC90值，以及与GluCl亲和力IC50值，建立QSAR模型，解析十六元环内酯衍生物杀虫活性的分子机制，并建立以谷氨酸配体门控氯离子通道（GLuCl）为靶标的化合物高通量筛选平台。项目将为新一代大环内酯杀虫杀螨剂开发提供技术支撑和理论依据。,论文设计思路,（1）在十六元环内酯化合物5、13位碳原子上，应用化学合成、生物合成等手段，构建
5、结构新颖、多样的衍生物6080个。以竹螟等为供试生物，系统测定各化合物的杀虫活性，得到各化合物对供试生物的LC50及LC90。 （2）克隆供试生物的谷氨酸配体门控氯离子通道（GluCl）基因，将其转入COS-7细胞，构建起转GluCl基因的细胞株。 （3）采用全细胞膜片钳技术，测定十六元环内酯化合物对供试生物GLuCl的激活能力（IC50），构建以谷氨酸配体门控氯离子通道（GLuCl）为靶标的化合物高通量筛选平台，建立起以化合物与受体作用的定量参数指导化合物结构改造的技术体系。 （4）以化合物的结构参数、杀虫活性LC50及LC90值和与GluCl亲和力IC50值，建立QSAR模型；从化合物结构
6、与GluCl特征解析十六元环内酯化合物杀虫活性的分子机制。得到以十六元环内酯化合物为基础的新农药分子模板。,2.研究目标及内容,本论文研究内容 1）十六元环内酯化合物的衍生合成 2）十六元环内酯化合物对供试生物活性测定 3）供试生物GLuCl基因克隆 4）GLuCl基因cDNA真核表达载体pcDNA3.1的构建 5）转GLuCl基因COS-7细胞株的建立及检测 6）全细胞膜片钳技术测定十六元环内酯化合物与GLuCl蛋白亲和力测定 7）建立基于杀虫活性及与GLuCl蛋白亲和力的天维菌素衍生物的QSAR模型,2.研究目标及内容,3.1十六元环内酯化合物的设计 系列（1）应用生物电子等排的分子设计思
7、路，在糖基的4-位引入甲氧基、氟、氯，氨基、巯基、三氟甲基等简单官能团，考察其取代基电性、取代基数目、取代位置的变化对杀虫活性的影响；初步设计20个化合物；,3.研究方法及试验方案,（ 4位）,系列（2、3）天维菌素的4位的异腈构建或13-位的异腈构建,3.研究方法及试验方案,（ 4位）,13-位,Chemical Papers, 2011, 65 (5), 739742 Tetrahedron Letters, 2009, 50, 19821985 Organic Preparations and Procedures International Volume, 2003, 35, 4,系列
8、（2、3）基于异腈参与的多组分反应多样性导向合成天维菌素衍生物；初步设计30个化合物；,3.研究方法及试验方案,胺源变化的Ugi and Passerini 反应： 胺基组分的变化：哌嗪、哌啶、一级胺、二级胺、羟胺（肟）、肼（腙）、磺酰胺、氨基酸。,系列（4）4-位引入醚、酯、酰胺、脒、脲、硫脲、磺酰基、磷酰基等活性单元，构建结构多样的天维菌素分子，以期在保留原有先导活性的基础上，降低其毒性，增加其渗透性和生物体内的传导或改变其活性谱和提高其选择性和理化性能。初步设计20个化合物；,3.研究方法及试验方案,3.2十六元环内酯化合物杀虫活性测定供试昆虫：选取竹螟、竹金针虫、竹笋夜蛾幼虫等试虫为供
9、试昆虫。供试药剂：合成的十六元环内酯系列化合物活性测定方法：采用叶碟法等测定供试化合物对试虫的毒杀活性。,3.研究方法及试验方案,3.3十六元环内酯化合物杀虫杀虫构效关系分析与研究 定量构效关系（QSAR）：以合成的衍生物的杀虫活性为依据，结合化合物结构上的变化，首先用Hyperchem软件中的MM+分子力学方法对分子的结构进行优化，然后用Mopac软件中的半经验量子化学方法AM1对分子的结构进行进一步的优化。将计算结果输入到CODESSA程序，计算化合物的各种结构参数，然后用启发式回归方法建立这些化合物的结构与其生物活性之间的定量函数关系，解释分子的结构与活性之间的定量关系。并推测理想的高活
10、性化合物的模型，指导新分子的设计合成。,3.研究方法及试验方案,3.4十六元环内酯高活性化合物的毒力、作用方式及作用机理的进一步系统测定以建立的QSAR模型为依据，选取4-5个高活性化合物，通过观察其对多种试虫表现出来的活性高低，确定该类化合物的毒力、杀虫谱，同时，对不同的试虫采用适当的给药途径和活性试测方法，进一步明确高活性化合物对试虫的作用方式。,3.研究方法及试验方案,以GLuCl为靶标的杀虫机理研究根据其他生物的GLuCl基因保守区域设计引物，提取供试生物RNA，扩增供试生物GLuCl基因的中间部分序列，采用5-RACE和3-RACE策略，扩增供试生物GLuCl基因的5末端和3末端，拼
11、接获得供试生物GLuCl基因cDNA全长，根据cDNA全长序列，设计引物，以供试生物RNA为模板进行反转录，扩增获得供试生物GLuCI基因的cDNA。将GLuCl基因cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1，通过脂质体转染技术将此重组表达载体导入COS-7细胞，SDS-PAGE检测验证GLuCl基因在COS-7细胞中的表达，培养转基因COS-7细胞备用。 化合物与供试生物GLuCl亲和力测定方法 采用全细胞膜片钳技术，测定天维菌素及其螺缩酮衍生物对肿瘤细胞GLuCl的IC50值，根据IC50值分析天维菌素及其螺缩酮上各种基团衍生基团对化合物与GLuCl蛋白的亲和力的影响规律。,3.5 十六元环
12、内酯高活性化合物的的成药性评价与探索利用各种制剂技术，可以开发出适合生物活性成分的微胶囊制剂、水基制剂和固体制剂，明确药剂的各种指标。3.6 十六元环内酯高活性化合物的的药剂应用研究将研制成功的制剂并进行林间（田间）药效试验，评价药剂的效果,3.研究方法及试验方案,（1）十六元环内酯螺缩酮等基团修饰是否是提高其杀虫活性的关键。（2）十六元环内酯螺缩酮等基团不同碳原子上不同取代基的性质对衍生物和GLuCl蛋白亲和力的影响规律。（3）建立以天维菌素为基础的新农药分子模板，为十六元大环内酯类化合物的结构改造及链霉菌基因改造提供方向。,3.研究方法及试验方案,3.7 拟解决的关键科学问题,4.预期进展
13、及成果,预期进展： 2014.7-2015.1：天维菌素衍生物合成，完成测定化合物活性，得到天维菌素衍生物60个以上；供试生物GLuCl基因克隆，获得GLuCl基因cDNA全长。 2015.2-2015.6：完成天维菌素衍生物构效关系研究；发表论文一篇； 2015.7-2016.6：测定天维菌素及其衍生物对供试生物GLuCl的作用机理；完成制剂研制和大田应用研究。预期成果：发表文章24篇，其中SCI 2篇； 申请专利12项。,5.工作基础,1. 产天维菌素工程菌的构建天维菌素是将对阿维菌素产生菌（除虫链霉菌，保藏登记号ATCC NO:31267）和米尔贝霉素产生菌（吸水链霉菌，保藏登记号CGM
14、CC No.7677）相关基因进行改造后，构建的工程菌产生的代谢产物。 2.天维菌素的毒性测定采用化合物对大鼠急性毒性测定方法，初步测定了天维菌素对SD大鼠的毒性。在饲药剂量为100mg/kg（体重）时，大鼠未出现死亡，大鼠仅表现出有体温降低现象，无其他显著变化。初步结论：天维菌素对大鼠的急性毒性LD50大于100mg/kg（体重），小于阿维菌素的毒性。毒性为低毒。 3.天维菌素杀虫谱活性研究明确了天维菌素对鳞翅目夜蛾科、菜蛾科、螟蛾科 的室内活性测定；天维菌素对鞘翅目幼虫的活性测定；活性教同类十六元环内酯化合物活性好；,工作基础,4. 天维菌素衍生物初步合成及活性测试在天维菌素C-5位进行了衍生合成，合成出5-脱羟基-5-肟-天维菌素，结构式为：,国家自然科学基金面上项目：天维菌素螺缩酮基团变构及其杀螨活性提高的分子机制 （C140505 ，2014-2017）校企合作项目：新型杀虫杀螨剂天维菌素（浙江海正药业有限公司，2013-2015）,项目支撑,谢 谢 大 家！,
