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1、实验报告实验项目名称：水稻愈伤组织的诱导和分化实验项目名称：水稻愈伤组织的诱导和分化实验项目性质：综合性实验实验项目性质：综合性实验所属课程名称：细胞工程所属课程名称：细胞工程班班 级：级：1414 生物工程生物工程 2 2 班班 学学 号：号：201430550215201430550215姓姓 名：刘明新名：刘明新指指 导导 老老 师师 ：陈忠正：陈忠正实验完成时间：实验完成时间：20172017 年年 5 5 月月 1 1 日日目录目录1 前言.42 材料与方法.42.1 仪器.42.2 设备.42.3 试剂.52.4 实验材料.53实验方法.53.1 配母液.53.2 配 NB 诱导、
2、分化培养基 63.3 高温高压灭菌63.4 接种室、培养基及用具表面消毒 .63.5 消毒剂的配制.73.6 种子去壳.73.7 外植体消毒.73.8 接种与观察（愈伤组织的诱导） .73.9 愈伤组织的再分化观察.84 实验结果.84.1 愈伤组织的诱导与分化84.2 实验结果分析.95 讨论分析.125.1 愈伤组织的诱导问题分析125.2 愈伤组织再分化问题分析125.3 操作分析.13参 考 文 献.151 1 前言前言在我国,愈伤组织的培养和应用已经越来越多以及成熟，如：优良植株的无性繁殖、无病毒植株的获得、优良植株的选育等等。同时，随着消费者对产品安全性要求的日益提高，植物细胞培养
3、的应用已愈来愈广泛，如：药用代谢产物的制造、作为天然食品或者食品添加剂、杀虫剂和杀菌剂、饲料等，不仅更安全，而且能很好地解决现今产品出现的各种问题。因此，愈伤组织的培养变得更加重要，而本实验则针对由水稻胚培养出愈伤组织的诱导形成幼苗的成功率进行了研究。愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。水稻成熟胚愈伤组织的诱导和再生是组织培养中的两个关键问题，它们涉及到外植体的脱分化过程和愈伤组织的再分化过程。影响水稻胚性愈伤组织形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、渗透压、外植体
4、来源、固化剂、培养基其它成份以及温度、光周期和继代时间等多个方面，其中材料和外源激素的种类、浓度和配比是最主要的因素。植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。2 2 材料与方法材料与方法2.12.1 仪器仪器万分之一电子天平、百分之一电子天平、超净工作台、高压锅、酸度计、磁力搅拌器及搅拌子、不锈钢过滤器、玻璃蒸馏水器、家用冰箱、超净工作台、培养室2.22.2 设备设备烧杯：100ml1， 500ml1 ；量筒：100ml3， 250ml1 ；磨口试剂瓶：100ml1， 500ml1；带盖试剂瓶：500ml2；三角瓶： 100 ml1，2
5、50 ml1，50ml2(无菌)，1000ml1；培养皿：9cm1；药匙；称量纸；牛皮纸；棉花塞；橡筋：若干、枪形镊：4；无菌滤纸：（10cm10cm）5；2.32.3 试剂试剂1N HCL；02N KOH；蔗糖（分析纯） ；琼脂粉；N6 大量：KNO3、CaCl22H2O 、MgSO47H2O、KH2P O4 、(NH4)2SO4；B5 微量：KI 、H3BO3、MnO4H2O、ZnSO47H2O、 Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCL26H2O、Na2EDTA、FeSO47H2O；B5 有机：盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、谷氨酰胺、水解酪蛋白、脯氨酸、2、4D、6-B
6、A、NAA；75%酒精，2% NaCLO，无菌水(400ml)2.42.4 实验材料实验材料水稻种子3 3 实验方法实验方法3.13.1 配母液配母液3.1.1 B5微量元素母液（1000/100ml）按配方的 1000 倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。用量极少的成分(如 CuSO45H2O、CoCL26H2O、Na2MoO42H2O)即使按 1000 倍称量仍很困难。3.1.2 N6大量元素母液（10） 、B5有机成分母液（100）配法同 3.1.1。3.1.3 2，4-D 母液(0.5mg/ml)用万分之一天平称取 2，4-D 50mg用少量 95%乙醇溶
7、解加水定溶为 100ml。3.1.4 6-BA 母液（1mg/ml)用万分之一天平称取 6-BA 100mg用少量 1N 盐酸溶解加水定溶为 100ml。3.1.5 NAA 母液（1mg/m l)用万分之一天平称取 NAA 100mg用少量 95%乙醇溶解加水定溶为 100ml。3.1.6铁盐母液（1000/1000ml）用百分之一天平称取 FeSO47H2O 27.8g， Na2EDTA 37.3g分别置于 1000ml 和500ml 烧怀，各加水 500ml加热搅拌，充分溶解趁热混合，冷却装瓶。以上各母液配好后分别装入磨口试剂瓶，贴上标签，写明名称、浓度和配制日期，置于 4冰箱保存。3.2
8、3.2 配配 NB 诱导、分化培养基诱导、分化培养基3.2.1 诱导培养基N6大量+B5微量+B5有机+30g/L 蔗糖+500mg/L 谷氨酰胺+500mg/L 脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+2mg/L 2,4-D+8.0g/L 琼脂粉 pH5.83.2.2 分化培养基N6大量+B5微量+B5有机+30g/L 蔗糖+500mg/L 谷氨酰胺+500mg/L 脯氨酸+1.25mg/LCuSO45H2O+300mg/L 水解酪蛋白+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA +8.0g/L 琼脂粉pH5.83.3 高温高压灭菌高温高压灭菌高压锅内加水将待灭菌物品放入锅内，盖好，打开排气阀和安全
9、阀通电水沸后排气 10 分钟关上两阀，压力升至 108KPa(1.1kg/cm2) 开始计时，维持此压力 20 分钟断电压力表降至 0 后，打开气阀放气，开盖，取出灭菌好的物品，放入培养室，倒平板。3.43.4 接种室、培养基及用具表面消毒接种室、培养基及用具表面消毒用 75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射 20 分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风 30 分钟后可进行无菌操作。3.53.5 消毒剂的配制消毒剂的配制3.5.1 75%酒精每组配 95ml。量取 95%酒精 75ml，加蒸馏水至 95ml 即可。3.5.2 2%NaClO0.5
10、%100 yX=(ml)x：应吸取的 NaCLO 原液的毫升数；y：NaCLO 原液的有效氯浓度。配 100mL。3.63.6 种子去壳种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备 30 粒去壳种子。3.73.7 外植体消毒外植体消毒在超净工作台内将米粒放入 50ml 无菌三角瓶无菌水洗一次弃水，倒入 75%酒精，搅拌，30 秒弃酒精，倒入 2% NaClO，不时搅拌，30 分钟弃 NaClO，用无菌水洗 3 次，每次停留 1 分钟倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。3.83.8 接种与观察（愈伤组织的诱导）接种与观察（愈伤组织的诱导）在超净工作台内将吸干的种子接入培养
11、基，注意使胚朝上。每瓶接 10 粒，每人 2皿。写上日期、接种人、放入培养室 25暗培养。1 周后调查计算污染率，2 周后调查计算愈伤组织诱导率。污染率(%)=100污染的种子数100形成愈伤组织的种子数 数组诱导率 (%)= 织的诱导3.93.9 愈伤组织的再分化观察愈伤组织的再分化观察在无菌条件下将诱导获得的愈伤组织（从约 3 周后安排此实验） ，从原材料中用镊子剥离后，接种到分化培养基中，每瓶接种 3 粒，每个同学接种 2 瓶，后置于光照条件下控制培养（25，2000lux 每天光照 10 小时下培养） ，观察分化出苗的状况（一般需接种的总种子数诱导率 (%)=100接种的总种子数要 2
12、-3 个星期的培养时间） 。1 个月后调查计算分化率。分化率(%)=l00分化植株的愈伤块数4 4 实验结果实验结果本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为 0 。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。最后，我组的 2 个培养皿分别可以诱导出 7 和 8 株水稻苗，诱导率分别为 70%和 80% 。4.24.2 实验结果分析实验结果分析4.2.1 愈伤组织诱导100%污染种子数 数组诱导率 (%)= 织的诱导 污染率(%)=100=25%100形成愈伤组织的种子数 数组诱导率 (%)= 织的诱导 诱导率 (%)=100= 75%分析说明：接种的总块数接种的总种子数接
13、种的总种子数1. 污染率的计算中，仅把一周后观察的染菌种子列入计算，并未考虑染菌的扩散；由于实验操作不当导致的皿壁染菌也未计入。2. 形成愈伤组织的种子数并不确切，这是由于小组成员们第一次诱导愈伤组织形成，尚不能明辨愈伤组织，以致我们本以为没有愈伤组织形成的种子，在清洗培养基的时候进一步分开种子的组织时发现其实是有愈伤组织形成的。因此，诱导率的计算并不能作为准确的实验结果。3. 不发芽的种子，可能因接种的种子本身营养不良或者在清洗的时候收到损伤。4.2.2 愈伤组织的再分化观察分化率(%)=l00%分化植株的愈伤块数=10/54l00% =18.52%分化率(%)=l00%分化植株的愈伤块数=
14、10/28l00% =35.71%5 5 讨论分析讨论分析5.15.1 愈伤组织的诱导问题分析愈伤组织的诱导问题分析愈伤组织的诱导和再分化，受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，生理功能上可能具有胚性，或是不具有胚性，在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，本实验为了提高诱导率，选用水稻种子作为外植体。一般的合成培养基都含有能满足离体组织生长所必需的元素，但各种类型的植物、接种的总块数接种的总块数器官所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的，对离子的形式也有不同要求。
15、培养基的物理性质对器官分化对形态发生有明显的影响；培养基的 pH 值对芽的分化也有一定的影响 ，通常把 pH 调整到 5.66.0 范围。培养基中的渗透压过低不利于发育，过高则导致细胞易破裂。培养基中激素种类和浓度水平直接影响到外植体能否有效地产生愈伤组织以及愈伤组织能否再分化出完整植株。本组组员在愈伤组织诱导阶段，出现了不同程度的染菌现象。最严重的达到整个平皿被杂菌覆盖，愈伤组织的生成受到严重影响，种子在脱分化过程中因杂菌影响而全部死亡。原因：经过观察，污染最严重的平皿上的杂菌分布是由一个种子扩散出来，最终占据整个平皿。所以，染菌原因可能是种子消毒不彻底。具体可能是 NaClO 消毒时间不够
16、，或者搅拌不到位，导致种子消毒不彻底，进而在后期培养中，杂菌繁殖覆盖平皿。另外，平皿的密封不彻底，后期密封遭破坏等，也有可能导致平皿染菌。5.25.2 愈伤组织再分化问题分析愈伤组织再分化问题分析光对器官的作用是一种诱导反应，各种植物的器官发生对光的要求是不同的。光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。光照长度对有正常光周期反应的植物的器官发生有明显影响。本实验中要求对愈伤组织的诱导进行暗培养，对愈伤组织的再分化进行光照培养。在组织培养中，一般都采用 2428的恒温条件进行外植体的培养。对一般植物来讲，可较好地形成芽和根。培养室的温度最好能保持有一定的日夜温差，这对器官的发生和生长都是有利的。愈伤组织再分化阶段，培养瓶中出现了红酵母污染愈伤组织的情况，长出了红色的菌斑。导致愈
