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1、营养代谢病检测技术第七章本章目的：本章要求了解营养代谢病检测技术的基本知识。本章重点：、血糖、蛋白质和脂肪代谢及微量元素测定。、消化吸收代谢过程本章难点：维生素测定。第一节蛋白质检测第二节血糖检测第三节脂肪代谢的检测第四节微量元素检测第五节维生素营养的检测主要内容一、血清总蛋白测定二、血清白蛋白测定三、血清蛋白电泳四、血红蛋白测定五、肌红蛋白测定第一节蛋白质检测（Ketosis in dairy cows）一、血清总蛋白测定原理：碱性溶液中蛋白质分子的肽键与铜离子作用，形成紫红色的复合物。这与两个尿素分子缩合生成缩二脲，在碱性条件下与铜离子作用形成紫红色反应相似，故称为双缩脲反应。一、血清总蛋
2、白测定试剂：6mol/L 氢氧化钠溶液：溶解 120g 氢氧化钠于去离子水中，稀释至 500ml，置聚乙烯瓶内盖紧保存。双缩脲试剂：称 3 g CuSO45H2O 和 9g 酒石酸钾钠（KNaC4H4O44H2O） ，先分别溶于蒸馏水，加入碘化钾 5g，待完全溶解后混合，加入 6mol/L 氢氧化钠 100ml，最后以蒸馏水加至 1L 置聚乙烯瓶内盖紧贮存。蛋白标准液：收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白质含量，亦可用定值参考血清或标准蛋白作标准。一、血清总蛋白测定操作：取三支试管按下表加入式样，混匀 37 摄氏度水浴放置十分钟，以空白管调零，540nm 波长测定吸光度。项目 测定管 标准管 空
3、白管血清/ml 1.00 蛋白质标准液/ml 1.00 理生盐水/ml 1.00 双缩脲试剂/ ml 5.00 5.00 5.00 二、血清白蛋白测定原理：在 pH=4.2 环境中，带正电荷的白蛋白（pI=4.9）可以与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，溶液由黄变蓝，在波长 630nm 具有最大光吸收，并与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。二、血清白蛋白测定试剂：溴甲酚绿（BCG）试剂：于 1L 容量瓶中盛蒸镏水约 400ml，加琥珀酸缓冲贮存液 100ml，用吸管准确吸取 BCG 贮存液 8ml 加入，并将内壁沾的染料冲洗入液体中，加叠氮钠存液2.5 ml
4、，聚氧化乙烯月桂醚贮存液 2.5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度，配好的 BCG 试剂 pH应为 4.15 0.05。白蛋白标准液：40g/L，也可用定值参考血清。均需置冰箱保存。二、血清白蛋白测定操作：血清白蛋白（g/L）= (Odu/Ods) 标准白蛋白浓度（g/L ）同时测定血清总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，可得血清球蛋白浓度，并可计算血清白蛋白/球蛋白比值。三、血清蛋白电泳电泳：带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。应用1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2. 分析某种物质的纯度及分子量电泳的基本原理电场中推动带电质点运动的力（F）等于质点所带
5、净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。FQE 质点前移受阻力（F）影响，球形质点服从 Stoke 定律，即： F6r（r 半径，介质粘度， 质点移速） 质点在电场中稳定运动时：FF即：QE 6r同电泳条件下不同物质因其分子大小（r）和带电量（Q）差异而有不同泳动速度，因此，一定时间可分离。按其泳动速度从正极端起即速度最快）依次为白蛋白、-球蛋白、- 球蛋白和 -球蛋白等条带，有的动物 -球蛋白和 - 球蛋白可分为两个条带。血清蛋白的 pI 大多在 7.5 以下，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋
6、酸纤维薄膜上分离成 A、1、 2、 和 五条区带。醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经 1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性实验操作及注意事项膜的预处理：将薄膜切成 2.58cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端 1.5cm 处用点样器蘸取新鲜血清
7、点样（不能看见有液滴形成） ，待血清进入膜内，移开点样器。电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，不能留有气泡，平衡 5 分钟，通电 1h。染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中 5 分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。定量：取 6 支试管，编号，分别用吸管吸取 0.4N NaOH 4ml；剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准） 。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序） ，用力摇动，使蓝色洗出，约半小时；用分光光度计进行比色，波长 650nm，以空白薄
8、膜条洗出液为空白对照，读取A、1、2、 球蛋白各管的光密度。结果计算：光密度总和 T A+1+2+ 白蛋白A/T100%1 球蛋白 1/T 100%2 球蛋白 2/T 100% 球蛋白 /T 100% 球蛋白 /T 100%【附注】电泳缓冲液要使两侧槽的液面保持水平，以免虹吸现象影响泳动速度。每次电泳时应更换电泳槽的正负极，以保持两侧缓冲液离子、pH 一致。使用一段时间后电泳缓冲液应废弃换新。关闭电泳仪电源后才能从电泳槽上取醋纤膜，以免电击。表 动物血清蛋白质参考值 （g/L）血清蛋白浓度增髙（髙蛋白血症）TP 增加：脱水引起，非绝对量升髙。红细胞压积容量（PCV)增髙，白蛋白蛋白比值（A/G
9、）正常。白蛋白增髙：单纯白蛋白升髙很少。球蛋白增加：-球蛋白（肝球蛋白、2-巨球蛋白、1-抗胰蛋白酶等）：组织损伤或炎症。-球蛋白（转铁蛋白、-脂蛋白、补体-3 及免疫球蛋白）：活动性肝脏疾病及圆线虫病。-球蛋白：慢性炎性、免疫性疾病，淋巴瘤、骨髓瘤、多克隆和肝硬化等，免疫接种。血清蛋白浓度降低（低蛋白血症）血浆水份增加，如静注过多低渗溶液。白蛋白降低：白蛋白/蛋白比值变小。营养不良和消耗增加，饲料蛋白质长期不足或慢性肠道疾病所引起吸收不良，或因长期患消耗性疾病。合成障碍：慢性肝脏疾病、肝脏功能严重损害。蛋白质丢失：大出血，烧伤，肾病综合征。妊娠期对蛋白质需要增加。球蛋白降低：喂初乳不足或未喂
10、初乳；肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂；免疫缺陷性疾病。四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）原理表面活性剂红细胞膜血红蛋白溶解高铁血红蛋白高铁氰化钾氧化氰离子棕红色氰化高铁血红蛋白540nm 比色血红蛋白浓度四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）试剂转化液：氰化钾 50mg，高铁氰化钾 200mg，无水磷酸二氢钠 114mg， Triton X-100 1.0ml，蒸镏水 1000ml。溶解混勾后用滤纸过滤，置棕色瓶中，保存于冷暗处，但勿使结冰，可保存数月。该液应透明、淡黄色，pH7.0 7.4，以蒸馏水作空白，在 540nm 处比色，吸光度应小于0.001。若浑浊、变绿则应废弃。四、血红蛋白测定（沙利氏
11、比色法）操作取血 20l 加 5ml 血红蛋白转化液，充分混匀，静置 5min。用波长 540nm，光径 1cm，转化液或水作空白，测吸光度计算血红蛋白（g/L) =测定管吸光度 (64458 44000) 251式中：64458 血红蛋白平均分子量，44000 血红蛋白摩尔吸光度，251 为稀释倍数。因品种、年齢和环境血红蛋白有差异，参考值 90120g/L四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）附注血液用 EDTA 二钠抗凝，不可用肝素钠抗凝。氰化钾为剧毒化学品，在配置和保存过程中应注意安全。测定废液应加次氯酸钠35ml/L) 混匀敞开过夜，使氰离子氧化成 CO2 和 N2 挥发后，再排入下水道中
12、。四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）临床意义血红蛋白占红细胞 32%36%，或干重 96%。在某些类型贫血时（如低色素贫血）红细胞与血红蛋白降低程度不一致，血红蛋白降低比红细胞明显。同时测定红细胞数与血红蛋白，对诊断有实际意义。血红蛋白增多：如血浆中水分丢失；红细胞增生活跃。血红蛋白减少：贫血性疾病；其中营养性贫血见于蛋白质缺乏，铜、铁、钴等微量元素缺乏， 维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12、叶酸、烟酸缺乏等。五、肌红蛋白测定肌红蛋白（Mb） ：横紋肌色素成分，分子量 170 kD。肌细胞内贮存和运输氧。肌肉组织损伤时 Mb 从肌细胞中释放入血，血清 Mb 升高，大部分以游
13、离状态存在，小部分与血清蛋白结合；肌红蛋白血症和肌红蛋白尿。测定方法：溶解度试验、比色法、放射免疫法、酶联免疫法、胶乳凝集试验、荧光免疫法、滴金免疫法等。五、肌红蛋白测定1、Mb 溶解度试验原理Mb 分子含血红素基团，有氧化酶活性，用联苯胺或邻甲苯胺同过氧化氢反应呈色鉴定，Mb 可溶解于 80%饱和度的硫酸胺溶液，而 Hb 则不能。试剂1%邻甲苯胺甲醇溶液：难溶解但较稳定。过氧化氢醋酸溶液：冰醋酸 1 + 3%过氧化氢 2。硫酸胺（化学纯）五、肌红蛋白测定操作先检尿液有无血红素存在，新鲜尿液 4 滴 + 邻甲苯胺液 2 滴，混合，+过氧化氢醋酸溶液3 滴，有蓝色或蓝绿色。取过滤后透明尿液 5m
14、l + 硫酸胺 2.8g，溶解混勾，静置 5 min，滤纸过滤。取滤液重复测试有无血红素色素存在，阳性表示含 Mb。阴性表示色素是 Hb。五、肌红蛋白测定2、反向胶乳凝集法原理Mb 与用 Mb 单克隆抗体致敏的羧化聚苯乙烯胶乳作用出现凝集者为阳性。试剂羧化聚苯乙烯粒子；pH 8.4， 0.1mol/L 硼酸-甘氨酸缓冲液；Mb 单克隆抗体；牛血清白蛋白。五、肌红蛋白测定操作用 Mb 单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯胶乳。取 250l 硼酸-甘氨酸缓冲液混合，逐滴加 1%羧化聚苯乙烯粒子 500l，边加边摇动试管混匀，加入 1mg 牛血清白蛋白置 37水洗30min，用硼酸-甘氨酸缓冲液洗两次后，放 4冰箱保存。取待检血清 10l，用 pH 8.4 硼酸-甘氨酸缓冲液做 1：20 倍稀释，取 25l 与等量致敏胶乳在玻片上混合摇动， 观察 3min，同时做阳性和阴性对照。五、肌红蛋白测定结果判断4+：全部呈粗粒状凝集，边缘有厚凝集圈，中间液体清亮3+：大部凝集，周围有凝集，中间液体微浑浊。2+：中度凝集，颗粒较细，凝集圈不显，液体浑浊。+：少量凝集，液体明显浑浊。-：保持均匀的乳状，与阴性对照相同。五、肌红蛋白测定附注理想的胶乳颗粒直径 0.81m ， 10.0 使反应完全抑制。加牛血清白蛋白可使胶乳表面的结合部位充分饱和，减少非特异性凝集。临床
