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1、,细胞免疫组织化学特殊染色方法,特殊染色用于显示标本中的一些结构，使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.,特殊染色,单一特殊染色,复合特殊染色,一种染料对一种组织结构或细胞进行染色,多种染料对多种组织结构或细胞进行染色,糖原染色方法：糖原为细胞内的多糖或粘多糖， 肝细胞和肌细胞内的糖原最多。 糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。例如： 先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、 淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内 都可聚集过多的糖原。, 过碘酸-雪夫反应 （periodic acid Schiff reaction， PAS)原理：用过碘酸氧化多糖结构的碳键，使其形成2-醛基，与无色的品红结
2、合生成紫红色品红复合物，沉淀于细胞内糖原分布部位，从而可证明多糖或粘多糖的存在。,1、试剂配制 （1）1%过碘酸水溶液：过碘酸 1g双蒸水 100ml将过碘酸溶于双蒸水中,（2）Schiff试剂：双蒸水 200ml碱性品红 1g1mol/L 盐酸 20ml偏重亚硫酸钠 2g（或亚硫酸氢钠）活性炭 300mg, 双蒸水煮沸后离火，慢慢加入品红，搅拌至完全溶解，冷却至50时过滤，加入盐酸，冷却至25时加入偏重亚硫酸钠摇荡，密封置于暗处或4冰箱内24h 。溶液呈草黄色时，加入活性炭摇荡1min快速过滤。避光4保存备用。,(3)亚硫酸氢纳溶液10%偏重亚硫酸氢纳 5ml1mol/L盐酸 5ml蒸馏水
3、90ml用前配制,(4)1mol/L盐酸36%盐酸 85.6ml蒸馏水 914.4ml,2、染色步骤,（1) 切片入1%过碘酸液 氧化2-5 min。充分水洗后，过蒸馏水。 （2）入Schiff 液10-20 min（室温 暗处） （3）入亚硫酸氢纳液洗3次每次2min（去非特异性染色）流水冲洗10min，过蒸馏水。 （4)Mayer苏木精复染2-3min。流水冲洗，过蒸馏水，吸干。从95%乙醇开始脱水、透明、封片。,3、对照,用1%淀粉糖化酶处理对照片20 min.或用唾液 （无气泡）消化对照片30 min 2次。,4、结果,细胞内糖原呈紫红色；对照片为阴性,5、注意事项： （1）糖原易溶于
4、水，要用冷Carnoy液固定（2）配制Schiff试剂碱性品红杂质太多， 或亚硫酸氢纳潮解，都不能使碱性品红脱色； 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，以免SO2逸出； 若Schiff试剂变成粉红色即失效。,Carnoy固定液: 取纯乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制， 现配现用。一般固定1-2 h。固定后的组织块 可直接入95%的乙醇脱水。,疏松结缔组织各种成分显示方法：疏松结缔组织中含有：胶原纤维、弹性纤维、网状纤维；巨噬细胞、肥大细胞。,一、 网状纤维分布：肝、肾、脾、淋巴结等器官内。纤维直径0.2-2.0m，分支多，交织成网。网状纤维主要由型胶原蛋白组成，表面被覆糖蛋白，在镀银切
5、片呈黑色称为嗜银纤维。,Gomoris镀银法显示网状纤维1、取材：淋巴结2、试剂配制（1）硝酸银溶液：硝酸银 10.2g，溶于100ml蒸馏水。（2）氢氧化钠溶液：氢氧化钠 3.1g，溶于100ml蒸馏水。,（3）银氨溶液的配置：取5ml 硝酸银溶液， 缓慢滴加氨水至溶液变得清亮；再加入5ml氢氧化钠溶液， 此时溶液变黑色再滴加氨水至溶液清亮后，补加4滴氨水，加蒸馏水稀释至100ml， 保存于棕色瓶中备用。,（4）高锰酸钾溶液：高锰酸钾0.5g，蒸馏水95ml，3%硫酸5ml （5）氯化金溶液：氯化金 0.2g，蒸馏水100ml （6）草酸溶液：草酸2ml，蒸馏水98ml（7）硫酸铁溶液：硫酸
6、铁2g，蒸馏水100ml （8）甲醛溶液：甲醛20ml，蒸馏水80ml,3、染色程序（1）新鲜组织10%甲醛固定，石蜡切片，常规脱蜡入水；（2）入高锰酸钾溶液中5min，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min；（4）硫酸铁中媒染2min，水洗1min；,（5）银氨溶液中处理1-5min（25 ），蒸馏水洗2次，各2min；（6）甲醛溶液中还原5min，蒸馏水洗2次，各2min；（7）氯化金溶中调色1-3min，蒸馏水洗2次；（8）95%及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。,4、结果 淋巴结内可见黑色网状纤维，粗细不等，交织成网。5、注意事项 配制氨银时氨液不可过多。,
7、二、弹性纤维分布广泛，弹性纤维较细，直径0.2-1.0m， 交织成网。富有弹性，与胶原纤维交织在一起。 弹性纤维核心部分由均质的弹性蛋白组成； 外周覆盖微原纤维。在皮肤学和检测幼年机体组织中的弹性结构。常用的显示弹性纤维的染色有： 地衣红染色、 Gomoris醛品红染色、 Weigert染色等。,地衣红染色显示弹性纤维1、取材 皮下组织2、染液配制 地衣红染液：地衣红0.1g ，70%乙醇100ml，硝酸2ml。 3、染色程序 （1）石蜡切片脱蜡下行至70%乙醇。 （2）地衣红染液，室温，12h或过夜，或37,15-30min. （3）70%乙醇分色，必要时可用0.5%-1%盐酸乙醇分色，去除
8、胶原纤维颜色。 （4）常规乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。4、结果 弹性纤维为棕红色，背景淡棕色。,三、胶原纤维胶原纤维，粗细不等，直径0.5-10m，波浪状，有分支交织成网。胶原纤维由型胶原蛋白组成。胶原纤维对酸性染料的亲和力强，如常用的酸性复红及苯胺蓝等，对胶原纤维有选染性，而其它组织不易着色，从而有利于其他组织的复染。显示胶原纤维的主要方法： 如van Gieson法、 Mallory法、 Masson法等。,Masson s三色染色法显示胶原纤维1、取材：皮下组织或肠系膜铺片2、固定：ZenkerBouin10%中性福尔马林缓冲液3、染液配制（1）Weigert铁苏木精 A液：苏木精
9、10g, 95%乙醇100ml B液：29%三氯化铁水溶液 4ml25%盐酸 1ml蒸馏水 95ml 用时甲乙两液等份混合，只能用数天。,（2）Masson 酸性复红染液： 酸性复红1g，冰醋酸 1ml，蒸馏水 99ml。（3）磷钼酸-磷钨酸水溶液： 磷钼酸 2.5g，磷钨酸2.5g，蒸馏水 100ml。（4）苯胺蓝染液： 苯胺蓝 2.5g，冰醋酸 2ml，蒸馏水 100ml。（5）1%醋酸水溶液： 冰醋酸 1ml ，蒸馏水 99ml。,4、染色步骤（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。（2）Weigert 铁苏木精染色，10-20min。（3）流水冲洗，10min，光镜下查看。也可用 1%盐酸乙醇
10、（70%）分色。流水冲洗，5min， 蒸馏水浸洗。,（4）Masson 酸性复红染液，15min，蒸馏水洗。（5）磷钼酸-磷钨酸水溶液分色，10-15min， 或至胶原纤维无红色。（6）苯胺蓝染液，10-20min，蒸馏水洗。（7） 1%醋酸水溶液分色，3-5min。镜下查看分色程度。（8）95%乙醇脱水上行，二甲苯透明，树胶封固。,5、结果：胶原纤维为蓝色；肌纤维为红色，细胞核为黑色。6、注意事项： 标本为10%福尔马林固定，切片染色前需用Bouin再固定，56 固定1h，或室温过夜。,伊红-醛复红染色法同时显示胶原纤维和弹性纤维Gomori氏醛-复红染液是Gomori在试验期间偶然 发现的
11、由碱性品红、三聚乙醛、浓盐酸配制而成。一、试剂配制 Gomori醛-复红染液： 70%乙醇100ml，碱性品红0.5g， 三聚乙醛1ml，浓盐酸1ml。注意：先将碱性品红溶于乙醇中， 然后加入三聚乙醛和浓盐酸，静置1-2d， 待溶液变为深紫色后，过滤置于冰箱待用。,三、制作过程1、取皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干。 2、放在甲醛-乙醇固定液内固定5min； 3、水洗3min； 4、置于醛-复红染液中，室温下染色5min； 5、水洗5min； 6、置伊红染液中，染色30s； 7、常规脱水、透明、封片。四、结果 胶原纤维为红色，长带状，波浪状走行；弹性纤维为紫色，细丝状，直行，末端卷曲。,二
12、、取材 皮下组织,甲苯胺蓝染色显示肥大细胞肥大细胞内含粗大的嗜碱性、异染性的水溶性颗粒，颗粒内含有组胺、肝素等活性物质，这些物质含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖类，能够与甲苯胺蓝、美篮、中性红、硫堇等染料结合。,1、取材 皮下组织2、固定 Carnoy液 或 10%中性福尔马林液 皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干后固定，或石蜡切片，冰冻切片更好3、染液配制 甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝0.2g 60%乙醇100ml混匀即可反复使用。,4、染色过程（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；（2）入甲苯胺蓝溶液染色，室温10-30min；（3）蒸馏水洗；（4）丙酮或100%乙醇脱水两次，各2min；（5）二甲
13、苯透明，树胶封固。5、结果 肥大细胞颗粒呈紫色，核浅蓝色。,胰岛内分泌细胞Massons三色染色法胰岛在胰尾部分布较多，胰岛细胞由A、B、D、PP 四种细胞组成，细胞间有丰富的毛细血管。 用 Massons，Mallory 等特殊染色 方法可区别 A、B、D细胞。1、取材 胰腺2、固定 ZenkerBouin10%甲醛,3、染液配制 （1）丽春红酸性品红液：丽春红 0.7g，酸性品红0.4g，冰醋酸 1ml，蒸馏水99ml，用1%的冰醋酸 溶解丽春红和酸性品红。（2）2%亮绿液：亮绿2g，冰醋酸 2ml 蒸馏水98ml，用2%冰醋酸溶解亮绿。,4、染色程序（1）切片脱蜡至水；（2）入0.5%碘
14、乙醇5-10min，自来水洗，蒸馏水洗；（3）入0.5%硫代硫酸钠3-5min；（4）Weigert 铁苏木精10-20min，自来水洗；（5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；,（6）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗；（7）入1%磷酸钼水溶液5min；（8）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸冲洗切片，将亮绿全部洗掉；（10）95%乙醇，无水酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。,5、结果 A 细胞染成红色，位于胰岛周边；B细胞染成紫红色，位于胰岛中央；D细胞染成绿色，位于A 细胞与B细胞之间。6、注意 用10%甲醛固定，再用重铬酸钾液处理，也获得较好效果。,甲
15、绿-派若宁染色显示DNA和RNA染色原理：甲绿和派若宁是碱性染料， 染色中甲绿-派若宁染色与DNA和RNA的聚合程度有关。 甲绿与聚合程度高的DNA亲和力较强；派若宁与聚合程度低的RNA有亲和力。一、固定 ZenkerCarnoy (4),二、染液配制 1、2%甲绿水溶液：甲绿2g，蒸馏水100ml甲绿提纯法：将甲绿溶解后，放入分液漏斗中， 加等量的纯氯仿洗，充分摇荡数分钟，静置， 待液体分层，放掉下层紫色氯仿液。按此法反复洗， 直至洗不下紫色为止，需洗5次左右。4保存。2、2%派若宁水溶液：派若宁 2g，蒸馏水100ml 此液提纯，应按甲绿方法进行。,3、醋酸缓冲液（pH值4.8）：0.2m
16、ol/L 醋酸 41ml，0.2mol/L醋酸钠 59ml。4、甲绿-派若宁染液：2%甲绿提纯液 7.5 ml，2%派若宁提纯液 12.5ml，醋酸缓冲液 30ml。此液用前配制。,三、染色程序1、切片脱蜡入水；2、切片入甲绿-派若宁染液5-10min；3、滤纸快速吸干，纯丙酮速洗分色；4、丙酮二甲苯混合液（1:1）速洗2次5、二甲苯透明，树胶封固。四、染色结果 DNA呈蓝绿色，RNA 呈红色。, 苏木精本身不是染料，不能单独使用， 因为对组织的亲和力很小。 苏木精必须氧化成苏木红才能染色， 常用的氧化剂如：氧化汞、过锰酸钾、 碘酸钠、重铬酸钾。氧化的苏木精脱掉二个原子的氢。 也可用无水乙醇配成10%干液，使其自然成熟。 氧化的苏木精为弱酸性，pH为6.5。 氧化后的苏木精还必须加入电解质，如铁矾、銨矾、 钾矾等即变成带有强电荷的碱性染料。 Mayer 苏木精：苏木精 1g蒸馏水 1000ml碘酸钠 0.2g甲矾 50g 加温溶解成紫蓝色，加水化氯醛50g及枸橼酸1g，溶液变成 红紫色，可长久保存。,
