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1、,细胞免疫组织化学特殊染色方法,特殊染色用于显示标本中的一些结构,使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.,特殊染色,单一特殊染色,复合特殊染色,一种染料对一种组织结构或细胞进行染色,多种染料对多种组织结构或细胞进行染色,糖原染色方法:糖原为细胞内的多糖或粘多糖, 肝细胞和肌细胞内的糖原最多。 糖原的多少,可以反映机体糖代谢的情况。例如: 先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、 淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤,肝细胞内 都可聚集过多的糖原。, 过碘酸-雪夫反应 (periodic acid Schiff reaction, PAS)原理:用过碘酸氧化多糖结构的碳键,使其形成2-醛基,与无色的品红结
2、合生成紫红色品红复合物,沉淀于细胞内糖原分布部位,从而可证明多糖或粘多糖的存在。,1、试剂配制 (1)1%过碘酸水溶液:过碘酸 1g双蒸水 100ml将过碘酸溶于双蒸水中,(2)Schiff试剂:双蒸水 200ml碱性品红 1g1mol/L 盐酸 20ml偏重亚硫酸钠 2g(或亚硫酸氢钠)活性炭 300mg, 双蒸水煮沸后离火,慢慢加入品红,搅拌至完全溶解,冷却至50时过滤,加入盐酸,冷却至25时加入偏重亚硫酸钠摇荡,密封置于暗处或4冰箱内24h 。溶液呈草黄色时,加入活性炭摇荡1min快速过滤。避光4保存备用。,(3)亚硫酸氢纳溶液10%偏重亚硫酸氢纳 5ml1mol/L盐酸 5ml蒸馏水
3、90ml用前配制,(4)1mol/L盐酸36%盐酸 85.6ml蒸馏水 914.4ml,2、染色步骤,(1) 切片入1%过碘酸液 氧化2-5 min。充分水洗后,过蒸馏水。 (2)入Schiff 液10-20 min(室温 暗处) (3)入亚硫酸氢纳液洗3次每次2min(去非特异性染色)流水冲洗10min,过蒸馏水。 (4)Mayer苏木精复染2-3min。流水冲洗,过蒸馏水,吸干。从95%乙醇开始脱水、透明、封片。,3、对照,用1%淀粉糖化酶处理对照片20 min.或用唾液 (无气泡)消化对照片30 min 2次。,4、结果,细胞内糖原呈紫红色;对照片为阴性,5、注意事项: (1)糖原易溶于
4、水,要用冷Carnoy液固定(2)配制Schiff试剂碱性品红杂质太多, 或亚硫酸氢纳潮解,都不能使碱性品红脱色; 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大,以免SO2逸出; 若Schiff试剂变成粉红色即失效。,Carnoy固定液: 取纯乙醇、氯仿、冰醋酸,按6:3:1的比例配制, 现配现用。一般固定1-2 h。固定后的组织块 可直接入95%的乙醇脱水。,疏松结缔组织各种成分显示方法:疏松结缔组织中含有:胶原纤维、弹性纤维、网状纤维;巨噬细胞、肥大细胞。,一、 网状纤维分布:肝、肾、脾、淋巴结等器官内。纤维直径0.2-2.0m,分支多,交织成网。网状纤维主要由型胶原蛋白组成,表面被覆糖蛋白,在镀银切
5、片呈黑色称为嗜银纤维。,Gomoris镀银法显示网状纤维1、取材:淋巴结2、试剂配制(1)硝酸银溶液:硝酸银 10.2g,溶于100ml蒸馏水。(2)氢氧化钠溶液:氢氧化钠 3.1g,溶于100ml蒸馏水。,(3)银氨溶液的配置:取5ml 硝酸银溶液, 缓慢滴加氨水至溶液变得清亮;再加入5ml氢氧化钠溶液, 此时溶液变黑色再滴加氨水至溶液清亮后,补加4滴氨水,加蒸馏水稀释至100ml, 保存于棕色瓶中备用。,(4)高锰酸钾溶液:高锰酸钾0.5g,蒸馏水95ml,3%硫酸5ml (5)氯化金溶液:氯化金 0.2g,蒸馏水100ml (6)草酸溶液:草酸2ml,蒸馏水98ml(7)硫酸铁溶液:硫酸
6、铁2g,蒸馏水100ml (8)甲醛溶液:甲醛20ml,蒸馏水80ml,3、染色程序(1)新鲜组织10%甲醛固定,石蜡切片,常规脱蜡入水;(2)入高锰酸钾溶液中5min,水洗1min;(3)入草酸溶液中漂白2min,水洗2min;(4)硫酸铁中媒染2min,水洗1min;,(5)银氨溶液中处理1-5min(25 ),蒸馏水洗2次,各2min;(6)甲醛溶液中还原5min,蒸馏水洗2次,各2min;(7)氯化金溶中调色1-3min,蒸馏水洗2次;(8)95%及无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。,4、结果 淋巴结内可见黑色网状纤维,粗细不等,交织成网。5、注意事项 配制氨银时氨液不可过多。,
7、二、弹性纤维分布广泛,弹性纤维较细,直径0.2-1.0m, 交织成网。富有弹性,与胶原纤维交织在一起。 弹性纤维核心部分由均质的弹性蛋白组成; 外周覆盖微原纤维。在皮肤学和检测幼年机体组织中的弹性结构。常用的显示弹性纤维的染色有: 地衣红染色、 Gomoris醛品红染色、 Weigert染色等。,地衣红染色显示弹性纤维1、取材 皮下组织2、染液配制 地衣红染液:地衣红0.1g ,70%乙醇100ml,硝酸2ml。 3、染色程序 (1)石蜡切片脱蜡下行至70%乙醇。 (2)地衣红染液,室温,12h或过夜,或37,15-30min. (3)70%乙醇分色,必要时可用0.5%-1%盐酸乙醇分色,去除
8、胶原纤维颜色。 (4)常规乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。4、结果 弹性纤维为棕红色,背景淡棕色。,三、胶原纤维胶原纤维,粗细不等,直径0.5-10m,波浪状,有分支交织成网。胶原纤维由型胶原蛋白组成。胶原纤维对酸性染料的亲和力强,如常用的酸性复红及苯胺蓝等,对胶原纤维有选染性,而其它组织不易着色,从而有利于其他组织的复染。显示胶原纤维的主要方法: 如van Gieson法、 Mallory法、 Masson法等。,Masson s三色染色法显示胶原纤维1、取材:皮下组织或肠系膜铺片2、固定:ZenkerBouin10%中性福尔马林缓冲液3、染液配制(1)Weigert铁苏木精 A液:苏木精
9、10g, 95%乙醇100ml B液:29%三氯化铁水溶液 4ml25%盐酸 1ml蒸馏水 95ml 用时甲乙两液等份混合,只能用数天。,(2)Masson 酸性复红染液: 酸性复红1g,冰醋酸 1ml,蒸馏水 99ml。(3)磷钼酸-磷钨酸水溶液: 磷钼酸 2.5g,磷钨酸2.5g,蒸馏水 100ml。(4)苯胺蓝染液: 苯胺蓝 2.5g,冰醋酸 2ml,蒸馏水 100ml。(5)1%醋酸水溶液: 冰醋酸 1ml ,蒸馏水 99ml。,4、染色步骤(1)石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。(2)Weigert 铁苏木精染色,10-20min。(3)流水冲洗,10min,光镜下查看。也可用 1%盐酸乙醇
10、(70%)分色。流水冲洗,5min, 蒸馏水浸洗。,(4)Masson 酸性复红染液,15min,蒸馏水洗。(5)磷钼酸-磷钨酸水溶液分色,10-15min, 或至胶原纤维无红色。(6)苯胺蓝染液,10-20min,蒸馏水洗。(7) 1%醋酸水溶液分色,3-5min。镜下查看分色程度。(8)95%乙醇脱水上行,二甲苯透明,树胶封固。,5、结果:胶原纤维为蓝色;肌纤维为红色,细胞核为黑色。6、注意事项: 标本为10%福尔马林固定,切片染色前需用Bouin再固定,56 固定1h,或室温过夜。,伊红-醛复红染色法同时显示胶原纤维和弹性纤维Gomori氏醛-复红染液是Gomori在试验期间偶然 发现的
11、由碱性品红、三聚乙醛、浓盐酸配制而成。一、试剂配制 Gomori醛-复红染液: 70%乙醇100ml,碱性品红0.5g, 三聚乙醛1ml,浓盐酸1ml。注意:先将碱性品红溶于乙醇中, 然后加入三聚乙醛和浓盐酸,静置1-2d, 待溶液变为深紫色后,过滤置于冰箱待用。,三、制作过程1、取皮下组织铺于干净的载玻片上,自然晾干。 2、放在甲醛-乙醇固定液内固定5min; 3、水洗3min; 4、置于醛-复红染液中,室温下染色5min; 5、水洗5min; 6、置伊红染液中,染色30s; 7、常规脱水、透明、封片。四、结果 胶原纤维为红色,长带状,波浪状走行;弹性纤维为紫色,细丝状,直行,末端卷曲。,二
12、、取材 皮下组织,甲苯胺蓝染色显示肥大细胞肥大细胞内含粗大的嗜碱性、异染性的水溶性颗粒,颗粒内含有组胺、肝素等活性物质,这些物质含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖类,能够与甲苯胺蓝、美篮、中性红、硫堇等染料结合。,1、取材 皮下组织2、固定 Carnoy液 或 10%中性福尔马林液 皮下组织铺于干净的载玻片上,自然晾干后固定,或石蜡切片,冰冻切片更好3、染液配制 甲苯胺蓝溶液:甲苯胺蓝0.2g 60%乙醇100ml混匀即可反复使用。,4、染色过程(1)石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水;(2)入甲苯胺蓝溶液染色,室温10-30min;(3)蒸馏水洗;(4)丙酮或100%乙醇脱水两次,各2min;(5)二甲
13、苯透明,树胶封固。5、结果 肥大细胞颗粒呈紫色,核浅蓝色。,胰岛内分泌细胞Massons三色染色法胰岛在胰尾部分布较多,胰岛细胞由A、B、D、PP 四种细胞组成,细胞间有丰富的毛细血管。 用 Massons,Mallory 等特殊染色 方法可区别 A、B、D细胞。1、取材 胰腺2、固定 ZenkerBouin10%甲醛,3、染液配制 (1)丽春红酸性品红液:丽春红 0.7g,酸性品红0.4g,冰醋酸 1ml,蒸馏水99ml,用1%的冰醋酸 溶解丽春红和酸性品红。(2)2%亮绿液:亮绿2g,冰醋酸 2ml 蒸馏水98ml,用2%冰醋酸溶解亮绿。,4、染色程序(1)切片脱蜡至水;(2)入0.5%碘
14、乙醇5-10min,自来水洗,蒸馏水洗;(3)入0.5%硫代硫酸钠3-5min;(4)Weigert 铁苏木精10-20min,自来水洗;(5)1%盐酸乙醇分化,自来水洗蓝化;,(6)入丽春红酸性品红液3-5min,蒸馏水速洗;(7)入1%磷酸钼水溶液5min;(8)倾去磷酸钼,直接用2%亮绿液染3-5min;(9)0.5%冰醋酸冲洗切片,将亮绿全部洗掉;(10)95%乙醇,无水酒精脱水,二甲苯透明,树胶封固。,5、结果 A 细胞染成红色,位于胰岛周边;B细胞染成紫红色,位于胰岛中央;D细胞染成绿色,位于A 细胞与B细胞之间。6、注意 用10%甲醛固定,再用重铬酸钾液处理,也获得较好效果。,甲
15、绿-派若宁染色显示DNA和RNA染色原理:甲绿和派若宁是碱性染料, 染色中甲绿-派若宁染色与DNA和RNA的聚合程度有关。 甲绿与聚合程度高的DNA亲和力较强;派若宁与聚合程度低的RNA有亲和力。一、固定 ZenkerCarnoy (4),二、染液配制 1、2%甲绿水溶液:甲绿2g,蒸馏水100ml甲绿提纯法:将甲绿溶解后,放入分液漏斗中, 加等量的纯氯仿洗,充分摇荡数分钟,静置, 待液体分层,放掉下层紫色氯仿液。按此法反复洗, 直至洗不下紫色为止,需洗5次左右。4保存。2、2%派若宁水溶液:派若宁 2g,蒸馏水100ml 此液提纯,应按甲绿方法进行。,3、醋酸缓冲液(pH值4.8):0.2m
16、ol/L 醋酸 41ml,0.2mol/L醋酸钠 59ml。4、甲绿-派若宁染液:2%甲绿提纯液 7.5 ml,2%派若宁提纯液 12.5ml,醋酸缓冲液 30ml。此液用前配制。,三、染色程序1、切片脱蜡入水;2、切片入甲绿-派若宁染液5-10min;3、滤纸快速吸干,纯丙酮速洗分色;4、丙酮二甲苯混合液(1:1)速洗2次5、二甲苯透明,树胶封固。四、染色结果 DNA呈蓝绿色,RNA 呈红色。, 苏木精本身不是染料,不能单独使用, 因为对组织的亲和力很小。 苏木精必须氧化成苏木红才能染色, 常用的氧化剂如:氧化汞、过锰酸钾、 碘酸钠、重铬酸钾。氧化的苏木精脱掉二个原子的氢。 也可用无水乙醇配成10%干液,使其自然成熟。 氧化的苏木精为弱酸性,pH为6.5。 氧化后的苏木精还必须加入电解质,如铁矾、銨矾、 钾矾等即变成带有强电荷的碱性染料。 Mayer 苏木精:苏木精 1g蒸馏水 1000ml碘酸钠 0.2g甲矾 50g 加温溶解成紫蓝色,加水化氯醛50g及枸橼酸1g,溶液变成 红紫色,可长久保存。,