第三部分 工业微生物杂交育种,Part I 微生物杂交,Part II 原生质体融合,Part I 微生物杂交,一、独特优点,二、杂交基本程序,（一）亲本及培养基的选择,（二）遗传标记,（三）杂交育种方法,三、细菌杂交,四、放线菌杂交,五、酵母菌杂交,六、霉菌杂交,Part I 微生物杂交(Hybridization),1、扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种 2、不仅克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低诱变剂的疲劳效应 3、通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展一、独特优点,二、杂交基本程序,亲本选择,亲本标记和亲和力测定,,,,,,,,,,（一）亲本及培养基的选择,亲本选择： 1、原始亲本：不同遗传背景的优质菌株 2、直接亲本：诱变后选出的具有遗传标记和 通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株,产量高,代谢快,产孢能力强,产量高,代谢快,产孢能力强,根据一些学者研究：最好采用一些有明显 遗传差异的近亲菌株作为直接亲本,,培养基： CM、MM、LM、SM（MM+[A]） LM（limited medium）： MM或蒸馏水+10~20%CM 专供异核体菌株生长使用的培养基,加入的量只限两个直接亲本少许生长，以提供 互相接触、吻合的菌丝体。
1、营养缺陷型标记 2、抗性标记 3、温度敏感性标记 4、其他性状标记,（二）遗传标记,单缺,双缺,多缺,抗逆性,抗药性,不耐高渗,耐高渗对温度敏感,孢子颜色,菌落形态,可溶性色素,,（三）杂交育种方法,与动植物不同，微生物中除了藻状菌纲、子囊菌纲具有明显有性生殖方式，可产生配子并进行结合外，大部分有重要经济价值的菌株是通过准性生殖方式杂交重组 1、原核微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分结合子，最终实现染色体交换和基因重组 2、丝状真核微生物通过接合、染色体交换，然后分离形成重组体常规杂交形式,杂交的本质,本质：不同菌株间遗传物质的转移、交换和重组 目前遗传物质转移的方式有接合、转化和转导 共同点：把受体菌（receptor）原来不具备的遗传物质由供体菌（donor）传递到受体菌中 接合：指两个性别不同的微生物细胞间接触，遗传物质转移、交换、重组，形成一个新个体三、细菌杂交,在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等 1944年，Avery等发现细菌可通过转化重组 1946年，Ledeberg和Tatum用营养缺陷型杂交成功 1953年，Hayes和Cavalli等证实细菌杂交需要有性因子即F因子。
一）F因子,,,,,,,,环状染色体,,F因子,F+菌株,F-菌株,Hfr菌株,游离状态,整合状态,F因子（fertility）：是一种质粒，存在也细胞质，一种稳定的遗传物质二）大肠杆菌杂交,,,,,,,,,,,,,,,,F+,F-,Hfr,F+,Hfr,Hfr,High frequency recombination,,2h,（三）中断杂交试验（interrupted mating experiment）,Hfr菌株单链转移到F-细胞是按照时间顺序进行的整条染色体全部进入F-菌株需2h如果在两个配对菌株接合过程中，每隔一定时间以强烈搅拌中断接合，结果导致Hfr菌株转移到F-菌株中染色体节段的断裂位置不一由此造成进入受体细胞具有Hfr性状的基因数量和种类不同从而可获得多样化类型的重组体四）Hfr和F-菌株杂交后形成重组体,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Hfr细胞部分基因,F-细胞整套基因,,有活性的重组子,单交换,双交换,,部分结合子,（五）Ｆ’菌株,由于Ｆ因子和Hfr细胞染色体间发生互换后得到一段染色体而产生的衍生性因子偶尔错误交换,Lac+,,,Lac+,Hfr细胞,F’质粒带Lac+,F因子,含有染色体基因的F因子,,（六）细菌杂交的方法与技术,亲本菌株的选择、标记、性别菌株的获得 杂交亲本菌株：不同遗传特性的菌株，带有选择性标记。
标记菌株 性别菌株的获得： F+菌株：F+ 菌株和F-混合培养、 F-菌株：F+菌株用不足以抑制生长的低浓度吖啶黄处理 Hfr菌株：F+菌株和F- 菌株杂交获得,（六）细菌杂交步骤,37℃,,,,,,,,Hfr,F-,1:10或1:20,,基本培养基,直接混合法,肉汤培养基,杂交,分离,营缺A,营缺B,四、放线菌杂交育种,1955年在天蓝色链霉菌中最早发现放线菌基因重组现象，以后许多科学工作者相继在土霉素、金霉素、新霉素和红霉素产生菌中进行过基因重组工作一）放线菌杂交原理,,,,A,B,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,混合培养,异核体,部分结合子,杂合系,重组体,A,B,A,,,不同于霉菌的异核体， 它不发生染色体交换,类似于细菌杂交,,放线菌杂交只发生在具有一定感受态菌株之间 例如：天蓝色链霉素中发现ＳＣＰ１因子放线菌属于原核生物，只有一条环状染色体放线菌基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系： （1）异核现象 有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝和菌丝间的接触和融合而形成异核体 所谓异核体即同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核异核体所形成的菌落在表型上是原养型，但其基因型分别与亲本之一相同，而无重组体出现。
2）接合现象 菌丝间接触和融合后，相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换接合现象的结果导致部分合子的形成 部分合子是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本染色体都不完整 3）杂合系的形成 部分结合子形成以后，在繁殖复制中，两种染色体进行一次交换，产生了杂合系，交换后的染色体是线性的它有一个二体区，即染色体的末端具有串联的重复结构 杂合系是由基质菌丝中长出的，形成菌落很小，能在基本培养基上或选择性培养基上生长杂合系上产生的分生孢子绝大多数是属于双亲本分离子，而重组体的数量很少4）重组体的形成 杂合系在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体不同区段还要进行几次交换根据所交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不同形成了一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型的分离子 杂合系是形成重组子的必经阶段杂合系,部分结合子,重组子,,,,,,现在常用的放线菌杂交方法主要有三种： 1、混合培养法 2、平板杂交法 3、玻璃纸转移法,（二）放线菌的杂交技术,his-ura-,met-str-,MM,重组体的检出,原养型重组体的检出：对营养要求表现略为两个原始亲本的表型，但从基因型而言，是新基因的重建。
MM,回复突变 互养杂合系 原养型重组体,制备平板时，可以选择性的对抗每个亲株的遗传标记之一，限制两亲株生长只有特定的异养型重组体可以生长 然后再进一步影印到选择培养基和基本培养基上选择培养基生长，基本培养基不生长的为真正的异养型重组体 生产能力比亲株低，在生产实际中价值不高异养型重组体检出,,杂合系菌落的分离,取混合培养孢子悬浮液分离到基本培养基平板上，在室温下培养3~4天，形成大小不同的菌落，其中较大的是一些原养型菌落，较小的是一些杂合系菌落，这些小菌落表面长有丰富的孢子杂合系细胞是染色体通过一次交换形成的 他们的孢子再分离到基本培养基上，容易发生遗传分离，几乎都成了两亲本分离子重组体极少MM 3-4d,,,,,,遗传分离,杂合系分析方法,,,,,,MM,,,,CM,,,CM,,点种,,,,,,Met Phe str,His ura,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,-str -met,-str,All,-str -phe,-str -his,-str -ura,CM,,,,,,,杂合系,,,,,,,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,1 2 3,-str -met,-str,All,-str -phe,-str -his,-str -ura,１,２,３,链霉素敏感型,组氨酸缺陷型,尿嘧啶缺陷型,链霉素抗性,Ｍｅｔ缺陷型,Ｐｈｅ缺陷型,链霉素抗性,Ｍｅｔ缺陷型,组氨酸缺陷型,亲本A 亲本Ｂ Met— Ｈｉｓ— Phe — Ｕｒａ— str,,,,,,,,,,MM,,,,,CM,玻璃纸 转移,,,分离子,杂合系菌丝,含链霉素 SM,Ｂ his-ura-,Ａmet-str-,玻璃纸转移,CM,玻璃纸,异核体不能生长,Ｂ菌株不能生长,Ａ菌株不能生长,,原始致育型,正常致育型,,,,,,A CM,B LM,SM,平板杂交法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,酵母菌的孢子的接合现象是在1819年发现的，1938年酵母菌杂交获得成功。
1950年揭开酵母菌接合系统的遗传控制，进一步证明了基因的分离规律和连锁现象 日本小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获得杂种，其乙醇产量和菌体生长量都比亲本高 面包酵母和酒精酵母杂交的杂种菌株的乙醇生产能力虽保持原有水平，但发酵麦芽糖的能力比亲株显著增强第四节 酵母杂交育种技术,一、酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌 无性繁殖：芽殖（budding） 裂殖（fission） 有性繁殖：形成子囊和子囊孢子,二、酵母杂交步骤 （一）标记菌株的选择 遗传缺陷型或抗性突变株 还可以根据菌落和细胞形态特征作为标记 首先是优良遗传特性的原始亲本 然后从两个原始亲本中分别选出不同接合型的单倍体菌株或单倍体的子囊孢子 最后采用适合的诱变剂处理单倍体菌株，获得遗传标记二）酵母杂交 1、子囊孢子的制备 杂交配对的菌株必须是单倍体的，所以要得到单倍体的子囊孢子具体实验时采用营养贫乏的生孢培养基，使二倍体酵母菌细胞在饥饿情况下发生减数分裂而形成子囊孢子 常用生孢培养基：无水醋酸钠0.82%，氯化钾0.186%，琼脂2%子囊孢子,加入液体 石蜡,,生孢 培养基,25-27℃培 养2-3天,,洗下 子囊孢子,加入蜗牛酶 震荡,,子囊 孢子石蜡层,,,,,,加1ml液体石蜡 5g硅藻土研磨10min,,,,,,单倍体 菌落,离心,2、群体杂交,把带有遗传标记的两亲本单倍体菌株接到完全培养液中，混合培养过夜，使两株细胞生长中充分接合，然后把混合液分离到基本培养基平板上，培养后形成二倍体的杂种菌落。
取接合细胞产生的培养液，划线接种或平板分离到基本培养基，室温培养后形成菌落，要注意观察其中大菌落的形成，这些大菌落可能就是异接合型的二倍体杂种划线分离，观察大菌落的形成,,酿酒酵母单倍体和二倍体细胞的区别,1953年报道了沟巢曲霉的准性生殖，此后利用准性生殖进行杂交的研究得到快速发展，尤其是不完全菌纲中微生物繁殖方式主要是准性生殖，而其中许多霉菌又都是发酵工业产品的主要菌种 不产生有性孢子的微生物除了主要进行无性繁殖外，还能进行准性生殖 所谓准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程准性生殖的整个过程包括三个相互联系的阶段，即异核体的形成； 二倍体的形成； 体细胞重组第五节 霉菌的杂交育种,,,,一、基本过程 （1）异核体的形成 当具有不同性状的两个细胞或两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的细胞核这样的细胞或菌丝体叫做异核体，这种现象叫异核现象 只有那些具有交配型（即感受态）的菌株之间才能形成异核体 异核体互补作用：两个基因型不同的细胞核处在同一个细胞质中，在生长过程中由对方提供所缺陷的营养因子2）杂合二倍体（AB/ab或AB：ab） 不同遗传型核的融合,,MM,划线分离单孢子,,MM,杂合二倍体 菌落,,,,异核体菌落,异核体自发核融合形成杂合二倍体的几率为10-6，常人工诱变的方法提高频率。
采用樟脑熏蒸或紫外线照射异核体的方法 具体操作时可以采取异核体的尖端菌丝进行处理。