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1、第五章 固相析出分离法,通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 结晶法,2,第一节 盐析法 (salt precipitation),定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性 缺点：分辨率不高，要除盐,3,两种现象： 盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大 盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小,4,一、基本原理,5,原理,形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 中
2、性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。,6,在盐析区，符合公式,logS=-Ks S蛋白质溶解度，g/L； 盐离子强度, Cii离子浓度，mol/L； Zii离子化合价； 常数,为纵坐标上的截距; Ks盐析常数。,7,、 KS,为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。 KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。 两种类型： （1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。 （2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作盐析法。,8,（一）、无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离
3、子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO4 3-SO42CH3COOClNO3INH4+K+Na+Li+ 盐析用盐常用硫酸铵,9,二、影响盐析的因素,(二）溶质（蛋白质等）种类的影响,10,盐析分布曲线,11,（三）蛋白质浓度的影响,12,蛋白质浓度提高，盐用量减少。,碳氧肌红蛋白,（四）温度的影响,13,温度的变化会影响值,在无盐或稀盐溶液中， 大多数蛋白质溶解度 是随温度升高而增大的， 但在高盐溶液中常相反,（五）pH的影响,当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，值最小。 利用值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质.,14,三、盐析操作,（一）盐析用盐的浓度表示 固体粉末硫酸铵饱和溶液常用“饱和
4、度”来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，25时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1 molL，定义它为100%饱和度.,15,（二）盐析方法和注意事项,1、分部盐析法 2、重复盐析法 3、反抽提法 一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。 将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。,16,分部盐析法,17,反抽提法(RNA聚合酶),18,注意事项,“局部过浓” 温度 （室温） 分离方法,19,第二节 有机溶剂沉淀 (Organic Solvent Precipitation),定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。,20,1、降低
5、了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。,21,一、基本原理,一些溶剂的介电常数,22,有机溶剂沉淀法优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。 缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆。,23,二、影响沉淀效果的因素,（一）有机溶剂种类及用量常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。,24,（三）温度（低温沉淀） 有机溶剂
6、存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。高盐：增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。,25,多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。胰岛素精制：,26,（五）某些金属离子的助沉淀作用,（六）样品浓度,浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白质浓度0.5%2%；粘多糖浓度1%2%。,27,第三节 其它沉淀方法,一、等电点沉淀法 对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。,28,胰岛素纯
7、化：胰岛素pH8除去碱性杂蛋白pH3除去酸性杂蛋白,金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法；有机酸类复合盐沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。,29,二、成盐沉淀法,1金属离子沉淀：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2生成有机酸类复合盐沉淀 （1）丹宁即鞣酸 （2）雷凡诺 （3）三氯乙酸（TCA）,30,雷凡诺,31,猪心提取液 洗脱液上清液 上清 细胞色素C沉淀（去除）,32,吸附,人造沸石,盐析,45%饱和硫酸铵,沉淀,TCA,透析,猪心中提取细胞色素C的工艺,三、亲和沉淀,利
8、用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。,33,34,胰蛋白酶提取工艺,四、高分子聚合物沉淀 水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 五、表面活性剂十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB） 十六烷基氯化吡啶（CPC）,35,酸性多糖,36,六、选择性变性沉淀法,热变性沉淀法 酸碱变性沉淀法 利用试剂（氯仿）,37,第四节 结晶(crystallization),定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。
9、通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。,38,一、结晶过程,指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程。 C2 小晶体的溶解度；C1 普通晶体的溶解度； 晶体密度；M 晶体质量； 晶体与溶液间的界面张力；2 小晶体的半径； 1 普通晶体的半径；,39,结晶包括三个过程：,(1) 形成过饱和溶液; (2) 晶核形成; (3) 晶体生长。,40,浓度温度图,41,二、过饱和溶液的形成(结晶方法),（一）、蒸发法 （二）、温度诱导法 （三）、盐析结晶法 （四）、透析结晶法 （五）、有机溶剂结晶法,42,温度诱导法,43,盐析结晶法,44,透析结晶法,45,（六）、
10、等电点法 （七）、微量扩散法 （八）、化学反应结晶法 调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。 （九）、共沸蒸馏结晶,46,等电点法,47,化学反应结晶法,48,综合利用,49,三、提高晶体质量的途径,工业上通常希望得到粗大而均匀的晶体，便于过滤与洗涤。 （一）、晶体大小影晶体大小的主要因素有过饱和度、温度、搅拌速度、晶种等。,50,（二）、晶体形状 改变晶体外形，可用:选择不同的溶剂、控制过饱和度、结晶温度、调节溶液的pH和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。 （三）、晶体纯度 晶体表面具有一定的物理吸附能力。重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶。,51,重结晶(rec
11、rystallization),溶解度受温度影响较大的物质，将产品溶解在热的溶剂中，缓慢降低温度析出晶体。 将溶质溶于一种溶剂中，然后将第二种溶剂加热后缓缓地加入，放置一段时间使结晶完全 。,52,红霉素重结晶,53,用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。,第六章 吸附分离法,54,55,吸附法(adsorption method)指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。,56,尿激酶的工艺,57,优点： (1)设备简单、操作简便、价廉、安全
12、。 (2)少用或不用有机溶剂，吸附过程中pH变化小，较少引起生物活性物质的变性失活。 缺点： (1) 选择性差，收率不高。 (2)一些无机吸附剂性能不稳定。,58,第一节 吸附法基本概念,一、吸附：物质从流体相（气体或液体）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用(adsorption)，在表面上能发生吸附作用的固体微粒称为吸附剂（adsorbent），而被吸附的物质称为吸附物（adsorbate）。,59,二、吸附类型,60,三、影响吸附的因素,（一）吸附剂吸附容量：比表面积、种类、活化状况吸附速度：颗粒度、孔径机械强度,61,（二）吸附物能使表面张力降低的物质，易为吸附溶解度：较小易吸
13、附极性吸附剂易吸附极性吸附物同系物吸附量变化有规律氢键,62,吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响,极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质； 极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质； 非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。,63,（三）环境的影响 1、溶剂：单溶剂易吸附，混合溶剂易解吸 2、pH值：PI 3、温度 4、盐的浓度：可能阻止、可能促进,64,（四）吸附物浓度和吸附剂用量,对蛋白质或酶进行分离时要求浓度1%以下。吸附剂用量。,第二节 几种常用的吸附剂,65,66,无机：白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土 有机：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂等 一、活性炭(activate
14、d carbon )粉末状，颗粒状，锦纶活性炭是吸附能力很强的非极性吸附剂溶剂中吸附力：水乙醇甲醇酯丙酮氯仿去色素、热原，用量0.021%加热活化 pH影响,67,辅酶A制备,68,活性炭提取放线酮,69,二、人造沸石(zeolite ),无机阳离子交换剂 Na2 Al2O4xSiO2yH2O Na2Al2O4=2Na+Al2O42-,70,71,三、磷酸钙凝胶,磷酸钙 磷酸氢钙 羟基磷灰石主要是其中的钙与蛋白质的负电基团结合,72,胰岛素纯化,73,四、白陶土(Kaolin ),可作为助滤剂与去除热原的吸附剂,74,五、氢氧化铝凝胶,将氨水或碱液加入铝盐形成的无定形凝胶； 吸附能力和陈化程度
15、有关。,75,六、氧化铝(Aluminum oxide),适用于亲脂成分的分离 1、碱性氧化铝： 2、中性氧化铝： 3、酸性氧化铝：,76,氧化铝吸附层析纯化维生素B12,影响因素： (1) Al2O3的颗粒度要均匀，流速控制要很慢； (2) 温度宜在20以下层析，洗脱在室温中进行； (3)利用B12在丙酮中不溶的特性，在冰冻条件下结晶3天，结晶析出。,77,七、硅胶(Silica gel),SiO2nH2O硅胶表面的硅羟基能吸附多量的水，称自由水，活性随自由水含量增加而下降。能吸附非极性化合物和极性化合物,78,CoQ10制备,79,洗脱剂的选择,极性溶质：极性大的溶剂洗脱能力大； 非极性溶
16、质：极性小的溶剂洗脱能力大。常用洗脱剂排序（极性增大）：石油醚甲苯 乙醚氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸,80,氧化铝或硅胶为吸附剂,洗脱剂从极性低的开始逐渐增加极性。次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、 丙酮、乙醇、甲醇、水 、乙酸。,81,活性炭为吸附剂,洗脱剂从极性高的开始逐渐降低极性。次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿。,82,第三节 大孔网状聚合物吸附剂,大网格吸附剂(macroreticular adsorbent ) （大孔网状树脂，macroreticular resin ）在树脂聚合时加入惰性的致孔剂，待网格骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的孔隙，其孔径远大于24nm，可达100nm，故称“大孔”。吸附能力不同 分子量大小,
