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1、动 物 生 物 化 学 实 验,实验三 血清蛋白含量测定,一、 实验目的,学习光谱光度法测定物质含量的原理掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的基本原理和技术,二、实验原理,1. 光谱光度技术原理,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。,光谱分析技术分类：,发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和 荧光光谱法,吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子 吸收分光光度法和红外光谱法,散射光谱分析技术：比浊法,吸光度与透光度,A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I,当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射
2、，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：,T = I/I0,T100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：,Lambert-Beer定律Lambert指出： 当一定的光线（I0）通过呈色溶液时，如果溶液的浓度（C）是一定的，则透过光线的强度（I）随通过液层的厚度（L）的增加成指数函数的减少，即I=I010-KL,Beer指出：当液层厚度（L）一定时，透过光线的强度随吸收光线物质浓度（C）增加而成指数函数的减少，即：I=I010-KC,I0,I,合并上两式：I=I010-KCL 取对数： -lgI/I0 = KCL A(
3、OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC,式中A为吸光度或光密度（optical density),也可用OD表示；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度,故Lambert-Beer定律可表述为：当一单色光透过呈色溶液时，光密度或消光度与被测溶液的浓度，液层的厚度成正比；透光度的对数与其成反比。A(OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC,据Lambert-Beer定律，当液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数()。的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时，在特
4、定波长下的吸光度值。是物质的特征性常数。 A(OD) = LC,2.分光光度法的定量分析 直接计算法： A(OD) =LCC = A/L标准管法 ： 对同一物质，在特定测定条件下， 是相同的常数A(OD)标 = LC标A(OD)未 = LC未,C未= A(OD)未 / A(OD)标 C标,标准曲线法：,C,OD,配制一系列浓度的标准品溶液，按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,（1）测定条件发生
5、变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。,（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。,（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。,（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。,3.分光光度计的基本结构,最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计,光源,单色器,比色杯,检测器,显示器,五大部份,结构：,4.分光光度计的使用,以721-B型分光光度计为例,（1）开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。,分光光度计的使用,（2）将波长旋至测定的波长。,（3）将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。,分光光度计的
6、使用,（4）将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。,分光光度计的使用,（5）将开关置于A，用消光调零调节A为0.0,分光光度计的使用,(6) 将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）,分光光度计的使用,5.蛋白含量测定-染料结合法实验原理,在酸性条件下，蛋白质分子可解离出带正电荷的 -NH3+，可同考马斯亮蓝G-250产生颜色反应，最大吸收为595nm，该方法操作简单，重复性好，最低测定值为1g。,三、实验试剂：,1. 标准蛋白液：1mg/ml的牛血清白蛋白2. 显色剂：100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml、95%乙醇中，再加入100ml磷酸，然后用蒸馏水稀释至1000ml。3. 样品液：稀释50倍的牦牛血清,四、实验操作：,取试管3支，按下表操作,混匀，2分钟后，测定各管在595nm处的光吸收，计算蛋白含量。,五、实验结果及分析,计算每100ml牦牛血清中含蛋白质多少克？2.分析实验结果,
