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1、凝胶层析技术（凝胶过滤）,目的：学习凝胶过滤法的工作原理和基本操作技术。 原理：凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固 定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。各物质在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直运动、扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒间隙中，所以向下移动的速度快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可进入凝胶颗粒的微孔之中，因此在向下移动的过程中，它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，这样不断进入和扩散，必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离。,目前
2、使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。,其结构如图：,由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子化合物。,实
3、验步骤,1、凝胶的预处理 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂，自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺
4、旋夹。,3、样品的加入吸取1ml血红蛋白核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱：加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。,四、凝胶层析的特点,1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。 2、设备简单，操作简便。,五、影响凝胶层析的因素,（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响40-60目为粗粒。100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响：一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi,
