植物细胞工程制药讲义

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1、第五章 植物细胞工程制药,第一节 概述 第二节 植物细胞的形态和生理特性 第三节 植物细胞培养的基本技术 第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素 第五节 植物细胞培养的生物反应器 第六节 进展与展望,第一节 概述,药物的1/4来源于植物; 人类对植物药资源的掠夺; 目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分; 植物细胞工程是以植物组织和细胞的离体培养为基础获取植物细胞或者各种代谢产物。,利血平、紫杉醇、可待因、奎宁等,现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸等。,第

2、二节 植物细胞的形态和生理特性,一、植物细胞的形态 二、植物细胞的结构特征 三、细胞后含物和生理活性物质 四、植物培养细胞的生理特性,二、植物细胞的结构特征,三、细胞后含物和生理活性物质(重点),细胞有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。 1、后含物：系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，即植物细胞的次级代谢产物。如糖类、生物碱、有机酸、挥发油、盐类、苷等； 2、生理活性物质：对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。,生物碱是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。 含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科等。

3、 亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。 一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。,糖苷类:指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。 洋地黄毒苷有强心作用； 大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用； 紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。,挥发油：一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类，含挥发油的中草药非常多。 在伞形科（当归、芫荽、白芷）、姜科（生姜、郁金）、唇形科（藿香）等植物中多有分布。 很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油、芫荽油等

4、。,有机酸：糖类代谢的中间产物。 植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。 常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、乌梅、Vc等。,酶类：是一种有机催化剂。酶反应一般在常 温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、 强碱和某些重金属离子，会使其失活。 大豆胰蛋白酶抑制剂：抗癌 菠萝蛋白酶：消炎、抗血栓、抗癌、免疫调节等 木瓜酶：软组织挫伤、咽喉炎等。,维生素：是一类复杂的有机物，常参与酶的成， 对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如 对难以生根的植物，用维生素B12处理后可促进不 定根的生长。 有的维生素人和动物自身都不能合成维生素，必须从植物中摄取。 维生素

5、C能阻止亚硝酸盐和仲胺在胃内结合成致癌物亚脱胺，从而减低癌的发病率。,植物激素：植物细胞原生质体产生的一类复杂的 调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂 和繁殖）产生作用，其量虽微，但作用甚大。 植物雌激素：异黄酮等治疗乳腺癌、前列腺癌、骨质疏松等。 物生长调节剂属于农药类，它们的毒性一般是低毒或微毒。矮壮素,抗生素：由微生物（如某些菌类植物）产生的能 杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、 链霉素等。 高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌 的物质，称为植物杀菌素 黄连素：广谱抗菌。 蒜素：消毒杀菌 阿拉伯芥的种子提取抗肝炎的抗生素,四、植物培养细胞的生理特性,1、植物细胞培养的

6、周期延迟期加速期对数期稳定期 2、植物细胞培养的特性,与动物细胞培养周期的异同？,植物培养细胞重量的增加：主要取决于对数期，,次级代谢产物的累积：主要在稳定期完成,2、 植物细胞的培养特性,、细胞大、有纤维素性细胞壁； 、细胞生长缓慢，易污染，需加抗生素； 、具有群体生长的特性：培养过程中易形成团块； 、植物细胞对光照有一定的要求； 、植物细胞具有结构和功能全能性：培养的细胞可以诱导分化成完整的植株。,动物细胞可以吗？,第三节 植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备 二、培养基及其组成 三、培养方法1、固体培养2、液体培养 四、药用植物细胞大规模培养方式,一、植物材料的准备,用于植物组织培

7、养的外植体，必须是无杂菌材料。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯的块茎等。,用于培养的植物组织或组织切片,二、培养基的及其组成,培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。,固体培养,固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化细胞培养。 固体培养的特点

8、是简便易行、所占空间小。但也有缺点，主要是营养光线不均衡现象。,固定化培养法 固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，将细胞固定于尼龙套内，或固定于中孔纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。 优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制条件。,Rhizome（根茎 ) culture in Bioreactor,0 day,20 days,悬浮培养,静止和振荡两类。 静止液体培养和固体培养一样，也具有简便

9、易行的特点，而且培养基还不会产生营养物质浓度差的现象。 振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振动下进行培养。这样可以防止上述静止培养的许多缺点。通常培养基的体积约占容器体积的20%。,四、药用植物细胞大规模培养方式,1、成批培养法将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。 植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期。 植物细胞的两步培养法， 第一个反应器用于细胞生物量的累积； 第二个反应器用于次级代谢产物的生产。,2、半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连

10、续培养法。 3、连续培养法 利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。,第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素,在植物组织和细胞培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有： 生物条件：外植体、季节、休眠、分化等； 物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（O2）、pH和渗透压等； 化学条件：无机盐（N、P、K等）、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等； 工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。,一、外植体选择,不同外植体的悬浮细胞培养物

11、，其最大次级代谢产物的累积时间各异。 同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积。 有的次级代谢产物累积是在延迟期进行， 有的则在加速期累积， 有的累积时间与细胞生长曲线同步，还有的则在稳定期大量累积次级代谢产物。,二、培养条件的影响,1、培养环境的内在因素 （1）接种和诱导：外植体的大小不仅影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的大小可能是使某些次级代谢产物含量发生变化的原因之一，此类现象常见于一些高产细胞株经继代培养之后。前处理也可影响累积方式。,（2）基本培养基组成： 基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础，尤其在稳定期次级代谢产物

12、累积时更是如此。磷：氮：铜： （3）碳源 ：碳源通常以光自养培养中的CO2或异养培养中的糖类两种形式提供，其性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。CO2可以诱导某些特征反应，如在金苹果的悬浮细胞培养中，高浓度CO2可产生一种特有的苹果香味。,植物细胞培养中使用最多的碳源是糖类，对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。,（4）植物生长调节剂 植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。 但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。 如在培养烟草细胞时发现，加入

13、IAA时培养物中有尼古丁生成，但2，4-D存在时则不合成该化合物。 说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。,（5）O2和pH O2 ：培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同， 通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。 pH：一般来说，最有利于培养细胞生长的pH在56之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，在培养过程中培养液的pH变化较小。,（6）渗出物：在细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物。 初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。 培养细胞分泌产物的量也取决于培

14、养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，酶的分泌量就达到了稳定期的水平，尔后酶活性随乙醇量的增加而降低。 次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。,2、两步培养法,第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基； 第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。,两步培养法的区别,生长培养基：为了实现细胞的高生产率，使用肌醇及维生素类成分，使用2，4-D刺激细胞生长 生产培养基：通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源，不含肌醇及维生素类，加入6-BA以便利于次级代谢产物的。,3、诱导子,植物抗毒素：是指在植物防御系统内能对

15、抗微生物进攻的某些次级代谢产物（根据其功能又称为“后感染防御物质”）。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一个反应，并形成特征性自身防御反应的分子。,诱导子的分类 一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子， 另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。,生物诱导子：是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子，降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。 非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。生物诱导子和非生物诱导子在其量效关系上也有区别。,4

16、、培养环境的外部因素,（1）温度 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为2028。 终产物和中间产物的累积，甚至与其生物合成直接相关的化合物，也并非需要相同的温度。 当培养温度与培养物正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应以及对次级代谢产物产生的激活作用。 温度的变化尚可引起产物类型在质和量上的改变，个别情况下由于激活了新的生物合成途径也可能产生新的代谢物质。,4、培养环境的外部因素,（2）搅拌频率：植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关。 具体表现：在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上，如上述因素产生甜菜苷的甜菜细胞和累积蛇根碱的长春花细胞等的影响就非常明显。 搅拌频率也不宜过小，如低于28r/min时，次级代谢产物的生物合成反应就有可能发生反转。,4、培养环境的外部因素,（3）培养容器的影响： 培养容器的大小和搅拌装置 如小规模实验室培养所用的培养容器（50500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。 用于生产次级代谢产物反应器中的搅拌器对细胞产率可产生一定的影响。,