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1、技术报告No. 26 (2008 修订版),Celebrating over 65 Years of Connecting People, Science and RegulationSM,除菌过滤器的验证 细菌的截留 第6.0部分,液体的除菌过滤,第 6.0部分 除菌过滤器的验证 / 细菌的截留,6.1 影响微生物截留的因素 6.2 细菌截留验证研究需要考虑的方面 6.3 挑战细菌的选择 6.4 培养的保持 6.5 培养条件和标准 6.6 有效挑战浓度 6.7 挑战水平 6.8 聚集 6.9 培养物的生存能力 6.10 挑战试验方法,6.11 试验用微生物的生存能力 6.12 试验步骤和方案
2、 6.13 非杀菌过程和液体 6.14 替代液体 6.15 杀菌液体 6.16 过滤介质vs.装置 6.17 压力/流量 6.18 持续时间 6.19 下游取样 6.20 试验用膜的选择 6.21 结果的解释 6.22 产品的生物负荷 6.23 过滤器构造的改变,目 录,除菌级性能的基本解释,除菌过滤是在对产品没有不良影响的前提下从流动的液体中去除微生物的过程。 ASTMF 838-05 是一种标准的内置TM，可以用于比较所有灭菌级的膜。 证明能去除一种标准试验细菌(Brevundimonas diminuta) 最低浓度为107 cfu/cm2 这是一个很好的开始，但是还要考虑其他因素,重要
3、参考 ASTM F 838-05,ASTM 标准 F838-05, “决定液体过滤器过滤膜细菌截留性能的标准测试方法”, 宾州Conshohocken美国测试和材料协会 ASTM 委员会 D19(2005) www.astm.org,除菌级表现的基本定义,2008 版 TR 26 进一步描述了过滤器验证需要考虑的方面除菌过滤器验证要考虑的两个重要因素: 通过适当的标准试验或同等的方法进行细菌挑战实验来决定过滤器膜的级别。 由过滤器的使用者或指定的测试机构（例如：过滤器生产商或契约实验室） 使用一种代表性的挑战微生物证明能完全去除一种产品或一组产品上的细菌。 在进行验证试验前，具有每组产品是按照
4、适当监管机构的规定生产和检验的科学依据。,挑战微生物的选择,以前一直推荐用 Pseudomonas diminuta 作为验证0.22 m 除菌级过滤器的细菌之选。 Pseudomonas diminuta 最近基于DNA的相同性被重新划分为Brevundimonas diminuta FDA并没有统一推荐某种细菌用于细菌截留试验 细菌大小应能通过 0.45 m 过滤器 其他符合要求的细菌也能被接受,时间,影响细菌截留的因素,微生物,大小,形状,产品,pH,渗透压,离子强度,表面活性剂,膜,孔径分布,表面化学成分,微孔结构,P,流量,温度,Section 6/6.1,产品,细菌截留验证需要考虑
5、的方面,对过滤过程进行详尽的评估，包括： 溶剂的性质 (如：水的，酸性的，碱性的, 有机的) 过滤时间 过程压力 过程流量 过程温度 过滤器设计说明 签约细菌截留试验，三大厂家会给一个POP文件 Satorious的所有试验都在德国，millipore的析出物试验在美国。,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,产品细菌截留验证研究应该包括多个过滤膜 (通常三个) 。最接近泡点的过滤膜做这个试验。市场流通的过滤器基本泡点都会比较高 在产品可能对膜造成伤害的情况下，膜的确切数量和测试设计取决于过程。,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,用于细菌截留验证试验的三个膜中至
6、少有一个膜应该在试验前或使用前物理完整性测试数值达到或接近过滤器生产商的测试要求。可能无法获得达到或接近过滤器生产商要求的膜在这种情况下，应该从一批使用前完整性测试数值尽量低的膜产品中选取测试膜。 然后根据（验证研究中）使用前物理完整性测试数值最接近生产商要求的膜来确定一个特定过滤过程的完整性测试要求,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,测试报告中应该包括细菌截留验证研究中得到的膜物理完整性测试值。 应在挑战测试前使用水、产品或其他有说明的液体来确定物理完整性,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,应该在产品细菌挑战后调查测试微生物是否在过滤器的下游重现。 如果调
7、查确认测试微生物穿过了过滤器，并且过滤器达到了完整性测试要求 那么应重新考虑该过滤器是否适合于这样的过程条件。,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,成分相同、只有浓度不同的系列产品可以通过挑战极限浓度和接受中间一组浓度来验证。 如果某个单个产品被认为是最差情况代表，则应伴有依据和数据。,Section 6.2,细菌截留验证需要考虑的方面,一般来说重复使用过滤器是不实际的，或者说不建议用于制药生产 但是如果重复使用除菌级过滤器 应该给出理由，并且重复使用参数应该经过验证。,测试设计的两种方法,1. 直接接种法2. 修改法 有时被称为: 间接法 两步法 再循环法,1. 直接注入细菌
8、法,直接接种测试,药品,可存活 微生物?,B. Diminuta / 挑战微生物,测试过滤器,泵,化验滤出液 的微生物,2. 间接法,药品,可存活 微生物?,化验滤出液 的微生物,否,改变 产品/过程,预处理过滤器,B. Diminuta / 挑战微生物,泵,测试过滤器,抗生素 防腐剂 温度 pH,1,2,预处理,时间 温度 化学性质,压力 流量,使过滤器暴露于实际的产品和过程条件中,抑制配方 预处理注入物,1,2,冲洗缓冲器: 去除过滤器的毒杀活动,维持全部 过程条件,验证此步骤 确保细菌活性,修改产品、过程的两个例子,8 小时过程时间 杀菌产品,预处理8 小时,修改过的产品 8小时,预处理
9、,截留测试,预处理4小时,实际的产品 4小时,冲洗,细菌截留研究的一般图示,细菌截留研究的一般图示,接种挑战溶液的再循环,研究设计决策树,Validation Strategy Study Design,Validation Strategy Study Design,Ideal Method / Approach,Validation Strategy Study Design,Alternative Approach,Validation Strategy Study Design,挑战微生物的选择 - 1.,推荐选择Brevundimonas diminuta 作为用于除菌级过滤器验证的
10、微生物。 但是: 请明白FDA或其他法规机构并没有推荐某一种微生物作为用于验证的唯一微生物。 微生物的尺寸应小到能通过 0.45 m 的过滤器 其他符合要求的微生物也可以接受。 必须建立挑战细菌符合要求的模型 必须清楚过程中的生物负荷对所选择细菌的影响,挑战微生物的选择 - 2.,推荐选择Brevundimonas diminuta 作为用于除菌级过滤器验证的微生物。 目前应用的培养方法有两种: 肉汤法 (Leahy and Sullivan, 1978) 冻膏法 (Fennington Jr. and Howard Jr., 1997) 两者都符合现行工业标准,有效挑战浓度,过滤后应该 过滤
11、器测试膜每平方厘米表面达到至少107 个微生物 均匀分布于膜的表面是最理想的 挑战浓度 (cfu/mL) 和挑战水平 (cfu/cm2).是不同的，不可混淆,有效的挑战水平,最低挑战水平应为每平方厘米膜表面至少 107 cfu B. diminuta (或生物负荷) 基于Bowman对0.45 m过滤器的观察 Bowman et al., J. Pharm. Sci., 56: 222 (1967) 0.45 m 过滤器截留数量 104-106 cfu/cm2 检查过大的孔 “除菌级”的定义,聚集,单分散性的细胞最适用于挑战 用光学显微镜甄选菌株 使用超声波/振动使其散开 通过光学显微镜和存活
12、计数予以确定 使用 0.45 m过滤器作为过滤器挑战测试中的阳性对照措施。,测试微生物的活性,确认挑战液体中微生物的活性 药物产品或替代物 微生物必须在整个挑战测试的过程中是存活的 如果损失了10倍的微生物，可能就不适合采用直接接种法来进行挑战测试。 挑战前后确定活性 使用可接受的微生物学方法，如 标准平板计数，用于上游分析 方法必须经过验证 (暗示) 使用相同的培养基分析滤出液中细菌存在的情况。 Section 6.9/6.11,抑菌/杀菌/非分散溶液,由于直接接种法是理想的 由于测试微生物活性的一些问题，一个成功的测试计划可能需要改变 挑战液体 挑战条件 或两者兼有 可能需要预处理过滤器
13、文件给出了定义毒性水平的指南,2. 直接法,可存活的 微生物?,否,改变 产品/过程,预处理过滤器,B. Diminuta / 挑战微生物,泵,测试过滤器,抗生素 防腐剂 温度 pH,1,2,药品,化验滤出液 中的微生物,产品或过程的改变: 抑菌/杀菌溶液,概述 决策过程一般不能被很好地理解。 图2 给出了大概的指南 首选始终是直接接种法。 第二个选择是改变产品/过程。 预处理过滤器需要与改变产品/过程结合起来进行。 文件提供了关于定义毒性水平的指南 (毒性大于 1 log) 文件没有试图把改变产品或程序的方法区分优先次序 必须科学地使决策合理化。,Section 6.15,压差和流量,应包括
14、最大过程条件 达到或超过已知压差 达到或超过已知流量 也许不能在小范围内同时模拟两者。 使用者决定哪个与特定的过程更相关 建立支持决策的理由,Section 6.17,化验和结果解释,可以用0.45 或 0.22 m过滤器从滤出液中回收微生物。 所有的滤出液必须经过化验 要认为一个过滤器对于某个过程来说是灭菌级别: 测试过滤器不能允许任何微生物通过 所有的阳性和阴性对照措施必须是有效的。 为确定微生物穿过了过滤器而进行重复测试是允许的,产品的生物负荷,产品的生物负荷必须经 辨认 确定特征 确定数量 过滤器生物负荷(即挑战水平)的计算 过滤器生物负荷=BV/A，那么 B = 微生物计数 (cfu
15、/mL) V = 总体积 (ml) A = 过滤器总表面积 (cm2) 过滤器生物负荷单位是cfu/cm2 允许使用者拿生产过滤器生物负荷与标准挑战测试生物负荷（107 cfu/cm2)相比较。 Section 6.22,设备测试的原理： 评估过滤器装置的完整性,要考虑到生产出来的装置可能没有截留作用 膜未封闭好 膜遭到了破坏 构件相交之处膜有缺陷 要考虑到不能依赖完整性测试检查出设备在生产过程中形成的缺陷。,滤介体 vs. 装置,选择膜盘还是装置取决于验证操作的目的 如果目的是验证膜的截留性能，那么使用膜盘进行缩小比例试验 完整性测试的方法必须有意义: 如: 建立泡点和扩散流之间的关系 膜的
16、完整性在安放膜的时候得以建立，在装置测试中得以确认。,扩大试验:滤介体 vs. 装置,膜盘是适用于验证过程过滤装置某些特征的一种模型。 过滤装置必须经过验证才能应用于生产过程中。,Section 6.16,盘测试的原因: 确保过滤装置完整性,过滤器最初的和过程中的完整性通过以下手段得以充分保证 证明过滤器与过程相匹配的充分研究 过滤器生产商质量系统审查 经验证的完整性测试 于过滤器使用前后恰当地执行,压差和流量,应包括最大过程条件 达到或超过已知压差 达到或超过已知流量 也许不能在小范围内同时模拟两者。 使用者决定哪个与特定的过程更相关 建立支持决策的理由,化验膜的选择,通常两者均可 0.45 m 或 0.22 m 用额定的分析过滤器回收测试微生物 一篇发表的论文支持使用0.45 m过滤器(J. Carter, PDA-JPST, Volume 50, No.3, 1996) 化验过滤器的选择应该经过验证,
