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1、第七章 发酵工程技术概论,第一节 概述,发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。,一、发酵的定义,1、传统发酵 2、生化和生理学意义的发酵 3、工业上的发酵,1、传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦
2、芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。,2、生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,3、工业上的发酵,泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括： 1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。 2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,二、发酵工程 主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术 特点： (1) 有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采
3、用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术； (2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术； (3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。,(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验 室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。 (5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。,三、微生发酵工程发展的历史,第一阶段。20世纪以前时期，传统的微生物
4、发酵过程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等。 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。” 巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。,第二阶段，1900-1940期间，新的发酵产品的问世。酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。 第三阶段，发酵工业大发展时期，青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。,第四阶段，基因工程阶段采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重
5、组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。,四、发酵工程研究内容,菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制。 发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和发酵设备。,第二节 优良菌种的选育,菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,分离思路,新
6、菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,生产选种,在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。,工业菌种的育种方针,工业菌种的育种：是运用遗传学原
7、理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,工业菌种育种的方法,诱变 基因转移 基因重组,育种过程,包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。 (2)希望基因型的选出。 (3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。,选择育种方法时综合考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)经济费用。 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的
8、认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,工业菌种改良方法,(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。,(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。,提高特定基因的表达水平,(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。 (2)诱导解除基因表达抑制的突变。
9、,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂： 化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用
10、化学诱变剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。,2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。 2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。,3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径
11、的完全中断。 4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。,原生质体育种,原生质体融合就是把两个亲株分别通过酶去除细胞壁，使菌体细胞在高渗环境总释放出由原生质膜包被着的球状体，在高渗条件下混合两个亲株的原生质体，由PEG作为助融剂使它们相互凝集发生细胞融合，接着两亲株细胞基因组由接触到交换，从而实现遗传重组，在再生细胞中就有可能挑选到较理想的重组子。,原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学
12、讨论会上提出来的。,原生质体融合育种的特点,(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 (二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 (三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。,(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 （五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。(六)提高菌株产量的潜力较大。(七)有助于建立工业微生物转化体系。,原生质体融合育种步骤,1标记菌株的筛选和稳定性验证。 2原生质体制备。 3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4
13、涂布于再生培养基，再生出菌落。 5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6生产性能筛选。,第三节 发酵的基本过程,菌种 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取精制,一、菌种,要求菌种产量高、生长快、性能稳定、溶液培养。,二、种子的制备,种子制备可以先在摇瓶中或小罐中进行，大型发酵罐的种子要经过两次扩大培养才能接入发酵罐。,三、发酵,在这一过程中微生物产生大量的目的产物，是发酵工序的关键阶段。 发酵中可供分析的参数有：通气量、搅拌转速、罐温、罐压、培养基总体积、黏度、泡沫情况、菌丝形态、pH、溶氧浓度、排气中二氧化碳含量及培养基中的总糖、还原糖、总氮、氨基氮、产物含量等。,
14、四、产物提取,发酵液的预处理和过滤 提取 精制,第四节 发酵方式 一、分批发酵,简单分批发酵是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作过程。放料后再重复投料、灭菌、接种、发酵过程。它以微生物生长、各种基质消耗和代谢产物合成都处于瞬变之中为特征，整个发酵过程处于不稳定状态。,在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。 在分批发酵工艺中低浓度培养基中的营养物质会迅速耗尽，引起微生物过早地从指数生长期向稳定期转变，这样，设备的利用率和产物的积累浓度都不高。,高底物浓度的优缺点,提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提高
15、发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度； 但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。 尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。,二、分批补料发酵,所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。,分批补料培养特点,分批补料培养技术是介
16、于分批培养相连续培养之间的一种发酵技术。 由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。 分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。,三、连续培养技术,与在密闭系统中进行的分批培养相反，连续培养是在开放系统中进行的。所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。,连续发酵法,从系统外部予以调整，使菌体维持在衡定生长速度下进行连续生长和发酵。 要维持这一衡定的速度，必须使发酵罐中发酵液的稀释度，恰恰等于该微生物的生长速度。 大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。,恒定状态可以有效地延长分批培养中的指数生长期。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。,连续发酵优点,高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率； 自控，便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量较稳定； 生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。,
