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1、脂肪酶催化合成生物柴油,实验目的,1、对脂肪酶进行固定化，同时对其进行活性测定。 2、熟悉酶法制备生物柴油的操作方法。 3、掌握酶法制备生物柴油的实验室制备方法。,实验原理,实验仪器和材料,材料：大孔吸附树脂、菜籽油、脂肪酶、95乙醇均为分析纯、 甘氨酸-NaOH缓冲液 、油酸甲酯 、仪器：电子台秤、磁力搅拌加热、恒温摇床 、真空泵1L/S、吸虑瓶、布氏漏斗、分液漏斗,实验步骤,一、固定化脂肪酶的制备1、树脂载体的预处理树脂载体用95%的乙醇洗涤数次，洗去未聚合的单体、制孔剂及其分解物、分散剂和防腐剂等脂溶性杂质，并且使打孔树脂充分溶胀。除去乙醇后用去离子水洗至无乙醇味。清洗干净的树脂浸泡于去
2、离子水中备用。,2、脂肪酶的固定化1g载体在使用前用0.2M PH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液平衡2h后，抽干。将一定量的脂肪酶粉溶于PH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中，在低温条件下中速搅拌10min，使之充分溶解。然后离心，取上清液，往其中加入经过预处理的载体，于低温条件下进行吸附。吸附后离心小心倾去上清液。,二、酶活力测定：,1.固定化脂肪酶活力的测定方法 橄榄油乳化法，将一定量的聚乙烯醇溶液和橄榄油按照一定的体积比（3：1）混合，再用超声波乳化成乳状液。取4ml乳化液和5mlPH9.0的缓冲液加入1mg/ml的酶，预热5min后，同时在另一三角瓶中加入乳化液做空白样，反应15min后
3、，向两瓶仲加入15ml 95%乙醇，终止反应，用0.05mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定，计算可得固定化酶的分解活力。水解橄榄油每分钟产生1mol游离的脂肪酸定义为一个酶活力。酶活回收率=(固定化酶的总活力/加入酶粉的总活力)100%,三、固定化酶催化合成生物柴油：,1、酶的预处理：先将酶在油酸甲酯中浸泡2 h，用菜籽油洗涤后，最后在菜籽油中浸泡12 h 。,2、酯交换过程合成脂肪酸甲酯： 在50ml具塞锥形瓶中，依次加入大豆油5g，甲醇0.99ml（醇油摩尔比为3:1），蒸馏水0.24ml ,固定化脂肪酶1.2g，置于40 ，180 r/min，PH=9.4条件下振荡反应48h。甲醇的加入方
4、法：分别在反应刚开始时、反应24和48 h时，每次加入甲醇总量的13(总的醇与油摩尔比为3：1)在分液漏斗中静置4 h，分去甘油层，用水洗至中性，干燥后得生物柴油。,3、 酯交换合成酯化率的测定: 在己酸乙酯合成的反应体系中，将摩尔浓度比为1：1.3的己酸和无水乙醇溶于正庚烷，制备己酸浓度为06molL的反应底物。在100mL具塞三角瓶中，加入5mL反应底物及04g脂肪酶，在35及150rmin振荡反应。反应16h后，取出样品100uL加入到5mL水溶液中，再用0025molL的NaOH滴定未反应的己酸，以1滴05酚酞为指示剂。,转化率 =脂肪酸减少的滴定摩尔数反应初始时的脂肪酸滴定摩尔数100,4. 酯化过程反应温度: 设5个反应温度，即25、30、35、40和45，用己酸乙酯合成的反应体系测定酯化率。,结论,
