色谱导论

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1、第二章: 色谱分析方法导论,主要内容,1 概述 历史、色谱分离过程、分类 2 色谱学基本概念 色谱图及相关术语 3 色谱法基本原理 描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述(塔板理论及速率理论) 4 分离度及色谱分离方程 分离度及色谱分离方程、影响分离的因素,第二章: 色谱分析方法导论,2.1 概述,析过程中，待测物与潜在干扰物的分离是最为重要的步骤！ 20 世纪中期以前，主要采用经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取等。 现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。 迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。,第二章: 色谱分析方法导论,色谱技术的发展历史： 1903年，

2、俄国植物学家最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素 chlorophylls “graphein”=write) 。 50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分析发展的要求。） 1937-1972年，35年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！,第二章: 色谱分析方法导论,2.1 概述,使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。 样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。 由于流

3、出速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。,第二章: 色谱分析方法导论,2.1 概述,色谱分离基本原理,色谱分类方法： 1) 按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。） 2) 按组份在固定相上的分离机理分：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。,第二章: 色谱分析方法导论,2.1 概述,3) 按两相状态分,

4、第二章: 色谱分析方法导论,2.1 概述,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（1）色谱分离过程：多组分混合物在流动相带动下通过色谱固定相，实现各组分分离。样品在色谱体系或柱内运行的两个基本特点： 一、混合物中不同组分在柱内的差速迁移(differential migration)； 二、同种组分分子在色谱体系迁移过程中分子分布离散(spreading)。,差速迁移：不同组分通过色谱系统时移动速度不同,组分通过色谱柱的速度，取决于各组分在色谱体系中的平衡分布。影响平衡分布的因素，即流动相和固定相的性质、色谱柱温等影响组分的迁移速度。 分子离散：指同一化合物分子沿色谱柱迁移过程中

5、发生分子分布扩展或分子离散。这种差别不是由于平衡分布不同，而是来源于流体分子运动的速率差异。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（2） 色谱流出曲线（色谱图chromatogram）混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,第二章: 色谱分析方法导论,（2） 色谱流出曲线（色谱图chromatogram）,2.2 色谱学基本概念,在气相色谱分析法中，将以组分浓度为纵坐标， 流出时间为横坐标，绘得的组分及其浓度随时间变 化的曲线称为色谱图，也称色谱流出曲线。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,色谱谱

6、带或色谱区带描述试样各组分在色谱柱内差速迁移和分子离散形成的浓度分布。 色谱图是柱流出物通过检测器产生的响应信号对时间或流动相流出体积的关系曲线图。它反映分离的各组分从色谱柱洗出浓度随时间的变化，从一个侧面记录下组分在住内运行的情况。,（2） 色谱流出曲线（色谱图chromatogram）,色谱图的基本特征：,在适当的色谱条件下，样品中每个组分均有相应的色谱峰，色谱峰一般呈对称的高斯曲线。色谱峰的区域宽度与组分的洗出时间(即保留时间)一般呈线性关系峰半高宽度或峰底宽度随组分保留时间呈线性增加。如果连续的色谱峰其中一个峰的半高宽度不规则增大，则可能该色谱峰中有一个以上组分。,色谱图是色谱分析的主

7、要技术资料。色谱图应标明色谱流动相、固定相、操作条件、检测器的类型和操作参数，样品类型及有关说明等。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（2） 色谱流出曲线（色谱图chromatogram）,色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数色谱保留值定性依据色谱峰高或面积定量依据色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（2） 色谱流出曲线（色谱图chromatogram）,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,保留时间tR：指待测组分从进样

8、到柱后出现浓度最大值时所需的时间, 如图中的O B。死时间tM：指不与固定相作用的气体（如空气、甲烷等）的保留时间，如图中OA所示。,（a）保留值,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,调整保留时间 tR：指扣除了死时间的保留时间，如图中的AB。 即：tR = tR tM,注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的基本参数。,（a）保留值,保留体积VR：指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的载气体积。VRtR F0 F0 色谱柱出口处载气流速 （mL/min）,死体积VM：指色谱柱内除了填充物固定相以外的空隙

9、体积、色谱仪中管路和连接头间的空间及检测器的空间的总和。VMtMF0调整保留体积VR：指扣除了死体积后的保留体积。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,用体积表示的保留值,（a）保留值,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,（b）相对保留值,相对保留值 r21：指组分2和组分1调整保留值之比，是一个无因次量。r21 = tR2 /tR1 = VR2 /VR1,注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了色谱柱对这两种组分的选择性。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3）

10、色谱基本术语,（c）区域宽度,标准偏差： 1/2EF1/4IJ（1/4Wb） 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 峰高 h：是色谱峰顶到基线的距离。h、是描述色谱流出曲线形态的两个重要参数 。h 、与的关系如何？,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,（c）区域宽度,半峰宽Y1/2: 峰高一半处色谱峰的宽度。如图中的GH。半峰宽与标准偏差的关系为：,注意：由于半峰宽容易测量，使用方便，所以一般用它来表示区域宽度。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（3） 色谱基本术语,（c）区域宽度,峰基宽度Wb：即通过流出曲线的拐点所作的切线在基线的

11、截距，如图I J所示。 Wb与的关系：Wb 4,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（4）色谱法中的主要参数和关系式 分配系数Kp和容量因子K ,（a）分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的浓度比。KPAs / Am（s固定相； m流动相） （b）容量因子K：分配系数与两相体积有关的参数，表示溶质A在两相中的质量之比。K=mAs / mAm=KPVS/Vm,分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，与流动相、固定相和温度有关。,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（c）分配系数Kp和体积保留值VR的关系,VR = VM + K

12、pVs即：VR = VM（1+ K）或：K（VRVM）/ VM 当流动相流速一定时有：K（tRtM）/tM tR/tM从上两式可以看到，色谱分析法中各组分保留值随K 而变化，而tM 、tR都可以从色谱图上测得，从而可以求出K。容量因子K是描述溶质保留行为的一个重要参数。,（4）色谱法中的主要参数和关系式 分配系数Kp和容量因子K ,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（d）分离比a,（4）色谱法中的主要参数和关系式 分配系数Kp和容量因子K ,色谱分析法中A、B两种物质的分离效率可用分离比表示。当两相体积一定时，分离比与保留值的关系为：aKp(B)/Kp(A)K(B)/K(A)

13、tR(B)/ tR(A)B，A在色谱法中，分离比等于被分离两种物质的调整保留值之比。tR(B)/ tR(A)B，A也称相对保留值。,下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（4）色谱法中的主要参数和关系式 分配系数Kp和容量因子K ,第二章: 色谱分析方法导论,2.2 色谱学基本概念,（4）色谱法中的主要参数和关系式 分配系数Kp和容量因子K ,若使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离

14、的前提下，提供足够长的色谱柱。第一、二点是完全分离的必要条件。 作为一个色谱理论，不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。,第二章: 色谱分析方法导论,2.3 色谱学基本理论,（1）色谱柱的效能塔板理论,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。,这理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，在每个塔板高度间隔内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后,挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，

15、挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。 尽管这个理论（概念）并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,第二章: 色谱分析方法导论,2.3 色谱学基本理论,（1）色谱柱的效能塔板理论,塔板理论假定： 1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达到平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。 当塔板数n 较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，

16、峰形接近正态分布。,第二章: 色谱分析方法导论,2.3 色谱学基本理论,（1）色谱柱的效能塔板理论,按照塔板理论，色谱柱的分离效能可以用塔板数来表示，由塔板理论导出的理论塔板数 n 的计算公式是： 注：使用该公式，分子分母应取相同单位。 可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。 若柱长为L，则每块理论塔板高度H 为,第二章: 色谱分析方法导论,2.3 色谱学基本理论,（1）色谱柱的效能塔板理论,第二章: 色谱分析方法导论,2.3 色谱学基本理论,（1）色谱柱的效能塔板理论,由于死体积VM (或死时间tM)内并没有发生分配作用，在考 虑柱的实际分离效能时应予扣除，扣除死时间后色谱柱效用有效塔板数n有效 和有效塔板高度H有效。,H有效L / n有效,由于同一色谱柱对不同物质的柱效能不同，故用H、n、H有效、n有效等指标表示柱效能时应注明被测物质和色谱条件。,1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等； 2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。 3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。,