酶免疫分析技术

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1、第七章酶免疫分析技术,目 录,返回总目录,3,酶免疫分析技术的分类,克隆酶供体免疫测定,酶免疫分析技术,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,酶放大免疫测定技术,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定,第一节 概述,一、基本原理,酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体(抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作用于底物的显色反应来判定结果。,二、酶和酶底物,标记酶的要求： 活性高，纯度高 作用专一性强 性质稳定，易与抗原或抗体偶联 测定方法

2、简便易行、敏感、精确 酶和底物对人体无害 酶和底物价廉易得,（一）辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ,HRP）,2.糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比,4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶,DH2十H2O2D十2H20,HRP催化的反应式为：,DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体,HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致

3、癌性。,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,（二）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP),是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取,AP的底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,（三）-半乳糖苷酶 （-galactosidase，-Gal）,源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。,-Gal 的底物,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）,酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计测量。,（四）其他酶,在商品试剂中，经常应用的酶还有

4、葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。,三、酶标抗体(抗原)的制备,制备要求：,抗原要求纯度高、抗原性强。,抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。,（一）常用的标记方法,标记方法要求：,方法简单，产率高 不影响酶和抗体(抗原)的生物活性 所得酶结合物稳定，本身不发生聚合 较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的 聚合物,1过碘酸钠氧化法,仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。,2戊二醛交联法,戊二

5、醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,（二）酶标记物的纯化与鉴定,1酶标记物的纯化,标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。,常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。,2.酶标记物的鉴定,（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。,（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记

6、率。,四、固相载体,（一）固相载体的要求,结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定； 可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲和素等大分子； 固相化后分子仍应保持活性； 固相化方法应简便、快速。,（二）固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。,3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。,微量反应板,返回章目录,第二节 酶联免疫吸附试验,一、基本原理,将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中

7、的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。,二、酶联免疫吸附试验的类型,（一）双抗体夹心法检测抗原,将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。,1.原理,双抗体夹心法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。,2技术要点,（+）,双抗体夹心法测抗原,双抗体夹心法

8、中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。,3注意事项,（二）双位点一步法检测抗原,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。,1原理,双位点一步法检测抗原,3.加酶作用的底物 显色,2.加待检抗原 和酶标抗体,1.已知抗体包被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（+）,3.加酶作用的底物 不显色,

9、2.加待检物（无抗 原）和酶标抗体,1.已知抗体包被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（-）,Y,Y,Y,双位点一步法测抗原,如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,2注意事项,（三）竞争法检测抗原,酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。,1原理,酶标抗原

10、,竞争法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。,2技术要点,竞争法测抗原,（四）间接法检测抗体,将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,1原理,间接法检测抗体,（1）将特

11、异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加稀释的受检血清，洗涤。 （3）加酶标二抗，洗涤。 （4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体的量。,2技术要点,间接法测抗体,（五） 双抗原夹心法检测抗体,将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,同双抗体夹心法。,1原理,2技术要点,双抗原夹心法检测抗体,4.加酶作用的底物不显色,双抗原夹心法测抗体,（六）竞争法检测抗体,同竞争法结合抗原。,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1原理,（1）竞争法检

12、测HBcAb： 将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,2技术要点,竞争法检测HBcAb,3.加酶作用的底物 显色,3.加酶作用的底物 显色,2.加待检抗体和酶标抗体,1.已知HBcAg包被载体,（+）,Y,Y,Y,Y,Y,E,2.加待检物（无抗 体）和酶标抗体,1.已知HBcAg包被载体,（-）,Y,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,E,E,E,E,竞争法检测HBcAb,（2）竞争法检测HBeAb： 将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 加入待检标本和HBeA

13、g，温育，洗涤。 加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,竞争法检测HBeAb,竞争法检测HBeAb,（七）捕获法检测抗体,将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。,1原理,（1）将抗人IgM链抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加人待检标本，温育，洗涤。 （3）加入特异性抗原，温育，洗涤。 （4）

14、加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。 （5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标比色仪测定结果。,2技术要点,固相捕获法检测lgM抗体,5.加酶作用的底物 不显色,捕获法,采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。,3注意事项,非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。,三、最适工作浓度的选择,（一）间接法检测抗体,（1）用100ng/ml人IgG进

15、行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。,1酶标抗抗体工作浓度的选择,（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。 （2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗涤。 （3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育，洗涤。,2棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度,（4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度

16、作为工作浓度。,间接ELISA法包被抗原最适工作浓度的选择,（二）双抗体夹心法检测抗原,（1）抗体用包被缓冲液稀释至浓度为10、1和0.1g/ml，分别在ELISA板上进行包被，洗涤。 （2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，温育，洗涤。,（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。温育，洗涤。（4）加底物显色，加酸终止反应后，读取A值。（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。,返回章目录,夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择,第三节 酶联免疫吸附试验 的应用和注意事项,一、 应用,1病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。 2蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。,