mirna介绍

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1、miRNA 介绍介绍miRNA 概述概述 miRNA 的研究起始于时序调控小 RNA（stRNAs）。1993 年，Lee 等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因 lin-4，2002年，Reinhart 等又在线虫 C.elegan 中发现第二个异时性开关基因 let-7，2001 年 10 月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似 C.elegan 的 lin-4的小 RNA 基因，称为 microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个 miRNAs。对一部分

2、miRNAs 的研究分析提示：miRNAs 参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。miRNAs 是一种 2125nt 长的单链小分子 RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列 RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的 miRNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基，是由具有发夹结构的约 70-90 个碱基大小的单链 RNA 前体经过 Dicer 酶加工后生成，不同于 siRNA（双链）但是和 siRNA 密切相关。成熟的 miRNA 5端的磷酸基团和 3端羟基则是它与相同长度的

3、功能 RNA 降解片段的区分标志。miRNA 独有的特征是其 5端第一个碱基对 U 有强烈的倾向性，而对 G 却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏 U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏 C。MiRNAs 具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs 的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA 在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的 miRNA 则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是 miR

4、NA 的表达的主要特点，又如拟南芥中的 miR-171 仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h 的果蝇胚胎提取物中可发现 miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的 miR-1 和 let-7 也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA 的又一特点基因表达时序性。MiRNA 表达的时序性和组织特异性提示人们 miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。在科研上，一个小 RNA 分子要成为 miRNA，需要符合以下条件：a）表达需要用 Northern-blot

5、来证实；b）小 RNA 分子必须是处在具发夹结构的前体 RNA 分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小 RNA 分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体 RNA 分子会在Dicer 功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明一个未知小 RNA 分子是否就是是 miRNA，具体地，如果小 RNA 分子符合上面的a（表达）和 b（结构）两条标准；或者 a（表达）和 c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用 cDNA 克隆的方法得到目标分子，并符合 c（保守性）；小 RNA 分子如果不是通过 cDNA 克隆的方法得到的，那么就必须符合 a（表

6、达）和前体 RNA 分子结构和保守性的标准才行；如果小 RNA 分子被推测为 miRNA，那么符合 c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小 RNA 分子就是 miRNA 分子。寻找 miRNA 的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如 MirScan 来寻找 miRNA 分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004 年 6 月， 吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选 miRNA 靶位点的方法。 用这种方法筛选 miRNA 的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及 miRNA 在物种间的 保守性。miRNA 基因

7、可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远 离任何已知基因的基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起. Uwe Ohler, Chris Burge 等人给出了一些可以提高寻找 miRNA 基因的准确性的一些附加条 件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。 MIT 的 Bartel and Chris Burge 报道了一种可以用来探测 miRNA 与其作用的靶基因之间的 关系的新的计算机的方法TatgetScan。他们针对已知的每一个 miRNA，扫描 mRNA 的数 据库DNA 转译为蛋白的生化信息，搜索与 m

8、iRNA 匹配的片段，然后对 miRNA 与 mRNA 的 匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的 mRNA 为该 miRNA 的靶基因。miRNA 的生成及作用机制的生成及作用机制与小分子 siRNAs 相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNAs 是由 dsDNA 在 Dicer 酶切割下产生，而成熟 miRNAs 的产生要复杂一些，首先 pri-miRNA 在核内由一种称为 Drosha 酶处理后成为大约 70nt 的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregor

9、y et al., 2004; Han et al., 2004)；这些 pre-miRNAs 在 Exportin-5 帮助下转运到细胞核外之后再由胞质 Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的 miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存在差别，成熟的 miRNAs 则是通过与 miRNP 核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶 mRNA 的翻译。在动物中，成熟的单链 miRNAs 与蛋白质复合物 miRNP 结合，引导这种复合物通过部分互补结合到 mRNA 的 3UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。而

10、在 siRNA 通路中，单链的 siRNA 结合到 RISC 复合物中，引导复合物与 mRNA 完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开 siRNAs，通过反义 siRNA 链识别目的 mRNA 片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA 也可以切割完全互补的 mRNA，而 siRNA 也可以阻遏 3UTR 具有短片断互补的 mRNA 的翻译。一般来说，一种 miRNA 它在 mRNA 上的识别位点有多个，而这种多个识别位点对于 miRNA 发挥其转录后抑制作用是必要的。3非编码区也是调控翻译的一个重要组成部分。一个转录本的总体结构由 5非编码

11、区(5Untranslated Region，5UTR)，编码区（Open Reading Frame，ORF）和 3非编码区（3 Untranslated Region，3UTR）组成。现已了解 3UTR具转录本特异性，它在 mRNA 转录后修饰、细胞内定位及转运、维持 mRNA 稳定性及保证翻译的效率方面都具重要的调控功能。3UTR 是发生 3末端加工的区域，包含各种顺式(cis-)作用元件，能够和特定的加工复合物互作以调控 mRNA 的 3末端加工。对哺乳动物的研究表明，真核生物中 3末端加工涉及 3UTR 内某个位点的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾Poly(A+)两个关键过程。应用缺失实验

12、和序列分析已确认了哺乳动物 mRNA 的 3UTR 包含了核心顺式作用元件。这类元件与加工复合物的相互作用是 3末端形成的核心机制，包括三部分：Poly(A+)位点，也可称为剪切位点(cleavage site， CS)，保守序列为 YA (Y 代表 T 或 C)的二聚核苷酸，这种保守序列的单碱基比例为 A T C G；Poly（A+）位点上游（5端）10-30 nt 处存在着保守的 Poly(A+)定位信号序列(以 AATAAA 为主)。Poly（A+）位点下游（3端）存在着稳定 3末端加工复合物作用的保守性稍差的 T/GT 丰富序列，称为下游作用元件。miRNA 基因是一类高度保守的基因家

13、族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4 为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响 mRNA 的稳定性，这种 miRNA 是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥 miR-171 为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与 siRNA 非常类似，最后切割靶 mRNA，这说明某些 miRNA和 siRNA 一样参与了机体内一些特异性 mRNA 的剪切过程。第三种以 let-7 为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割 mRNA，如果蝇和 Hela细胞中 let-7 直接介导 RISC 分裂切割靶 mRNA；当与靶标基因不完

14、全互补结合时，起调节基因基因表达的作用，如线虫中的 let-7 与靶 mRNA3端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。对于 miRNAs 的研究已经成为目前的一大热点，而种种迹象表明 miRNAs 可能是一类与肿瘤发生有关的新的基因。像 miRNA-15a 和 miRNA-16a 与 CLL 有关，miRNA-142 则与侵袭性的 B 细胞性白血病有关。研究发现，一些 miRNAs 能够在肿瘤形成中发挥作用，可以作为肿瘤抑制基因；另外一些 miRNAs 则是作为癌基因存在。植物 miRNA 从 2002 年起才有报道，编码植物 miRNAs 的基因明显不同于其他生物：植物编码 miR

15、NA 基因的转录产物可能更大，植物的 miRNA 与互补结构的错配一般也少于动物，在进化上表现地更为保守。但和动物miRNA 一样，miRNA 的转录产物也是发夹状结构，在 RNase酶切割后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA 成熟。科学家们已发现 miRNA 在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发生，动物胚胎及组织发育等。例如，在 carpel factory (car) 突变株中 3 个 miRNAs 的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似 Dicer 的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少

16、 miRNAs 加工而造成的。多数的植物 miRNAs 在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育过程。Brennecke 等人利用电脑寻找靶标基因，证实了 miRNA不完全结合 3UTR 中存在细胞死亡诱导基因，这提示说明 miRNA 对生长发育进行更为重要的调控作用。尽管现在研究者们对于 miRNAs 的认识越来越深刻，仍然有很多的猜想需要证实，比如对 miRNAs 的潜在的生物学效应的猜测；miRNAs 在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要；miRNAs 可能代表一个新层次上的基因表达调控模式，等等。所以说，大多数 miRNAs 的功能仍然是个谜，有待于研究者们更深入的研究。