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1、第十七章 合成抗菌药物的分析,第一节 喹诺酮类药物的分析,结构通式,一、化学结构与性质,（一）化学结构,喹诺酮类按发明先后及其抗菌性能的不同，分成四代：,第一代：抗菌谱窄，仅对大肠杆菌、痢疾杆菌和变形杆菌等少数几种菌有效。代表药物为：萘啶酸、吡咯酸，因疗效不佳，副作用大，现已完全被淘汰。,第二代：于1980年推出，抗菌谱有所扩大，因吸收代谢后在尿液和胆汁中浓度很高，故对急慢性肾盂肾炎、膀胱炎和前列腺炎等尿路感染及胆道感染、菌痢和肠炎等疗效更好。代表品种为吡哌酸(PPA)、新恶酸和甲氧恶喹酸等。因副作用仍较大，故目前除PPA偶用外，其他已淘汰。,第三代：于上世纪80年代问世，抗菌谱更为扩大，抗菌
2、作用更强，较低浓度即显抗菌活性。可对抗耐药性葡萄球菌等革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌疗效更佳。因本类药物分子中均含氟原子，故称又“氟喹诺酮类”。这类药物用于治疗重感染及反复发作的慢性感染，特别是泌尿系统感染。主要品种有：诺氟沙星（氟哌酸）、氧氟沙星、环丙沙星等等。这一代是目前临床应用最为广泛的沙星类药物。,第四代：近年国外研制出第四代喹诺酮类抗菌药物，与第三代相比，除保持6位氟取代的结构外，于5位或者8位引入氨基或甲基及甲氧基的衍生物，从而使光敏反应降低，不良反应更小，抗菌谱扩大，药代动力学得到改善。 主要有莫西沙星、加替沙星、司帕沙星及左氧氟沙星等。,典型代表药物的结构,第一代喹诺酮类抗菌药,
3、第二代喹诺酮类抗菌药,第三代喹诺酮类抗菌药,第四代喹诺酮类抗菌药,与氧氟沙星的关系？,第三代喹诺酮类抗菌药,第四代喹诺酮类抗菌药,（氟哌酸）,莫西沙星,加替沙星,第四代喹诺酮类抗菌药,第四代喹诺酮类抗菌药,（二）性质,1,一般为类白色或淡黄色结晶,6,酸碱两性,羧基-酸性,碱性氮原子-碱性,溶 解 性,2,在水和乙醇中溶解度小，在碱性和酸性水溶液中有一定的溶解度,紫外吸收光谱特征,3,分子结构中具有共轭体系，在紫外区有特征吸收，利用此性质可进行鉴别或含量测定。,4,旋 光 性,4,左氧氟沙星具有旋光性，氧氟沙星、环丙杀星等无旋光性。,6,5,与金属离子反应,结构中3、4位为羧基和酮基，极易和金
4、属离子形成螯合物，降低抗菌活性。不宜和牛奶等含钙和铁离子的食物或药品同时服用。同时长时间使用会使体内的金属离子流失，尤其对妇女，老人和儿童可引起缺钙，缺锌和贫血等副作用。,5,分解反应,6,喹诺酮类抗菌药遇光照可分解，对病人产生光毒性反应，因此使用前后均应注意避光。 光敏反应是喹诺酮类药物的主要不良反应。 临床症状：光暴露部分皮肤出现痒性红斑，严重者可引起皮肤脱落糜烂。,光毒性反应：,光变态反应：,光敏反应,药物、光降解物或中间体、代谢产物等在光和氧存在的条件下可以产生单线态氧（1O2），导致光敏毒性。,迟发型过敏反应，吸收紫外线呈激活态的光降解物或中间体与机体表皮蛋白结合形成全抗原，导致过敏
5、反应。,二、鉴别试验,（一）与丙二酸的反应,ChP2010采用与丙二酸反应对诺氟沙星软膏和乳膏进行鉴别。诺氟沙星乳膏【鉴别】取含量测定项下的供试品溶液5ml，置水浴上蒸干，残渣中加丙二酸约50mg与酸酐1ml，在水浴中加热10分钟，溶液显红棕色。,叔胺化合物，与丙二酸在醋酐中共热时，有棕色、红色、紫色或蓝色呈现，反应机制不明。,NaOH溶液,左氧氟沙星的UV鉴别【鉴别】取供试品适量，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含5g 的溶液，在226nm与294nm的波长处有最大吸收，在263nm的波长处有最小吸收。,（二）紫外-可见分光光度法,利用紫外吸收的性质。,ChP2010对
6、氧氟沙星、诺氟沙星和氟罗沙星用TLC法鉴别。 氟罗沙星【鉴别】取供试品与氟罗沙星对照品适量，加三氯甲烷-甲醇(4:1)制成每1ml含1mg的溶液，分别作为供试品溶液与对照品溶液；另取氟罗沙星对品与氧氟沙星对照品适量，加三氯甲烷-甲醇(4:1)制成每1ml含氟罗沙星1mg和氧氟沙星1mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。,（三）薄层色谱法,吸取上述三种溶液各2l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨溶液(5:6:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视，系统适用性试验应显示两个清晰分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的位置和荧光应与对照品溶液主斑点的位置和
7、荧光相同。,ChP2010规定：喹诺酮类药物含量测定项下的供试品主峰应与相应对照品主峰的保留时间一致。ChP2010收载的喹诺酮类药物均采用高效液相色谱法进行鉴别。,（四）高效液相色谱法,盐酸环丙沙星的鉴别：供试品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。,（五）红外光谱法,四、特殊杂质检查,左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星),左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋异构体，在其合成过程中必然会产生光学异构体副产物。中国药典规定了左氧氟沙星原料药物中右氧氟沙星的限量，采用配合交换手性流动相法测定。,氧氟沙星：BP和EP收载了6个已知杂质（表17-2），ChP2010收载了2（A和E）个已知杂质. 左氧氟沙星也有结构
8、相同而立体构型不同的杂质。,四、特殊杂质检查,直接法：,HPLC分离手性对应体的方法：,间接法：手性试剂衍生化法,手性固定相法（CSP）,手性流动相添加剂法（CMPA）,CMPA,手性包含复合：环糊精，手性冠醚等,手性配合交换,手性离子对 动态手性固定相 手性氢键试剂 蛋白质复合物 手性诱导吸附,手性配合交换：流动相中加入手性金属配合剂，与对映体形成三元非对映体配合物，根据它们结构稳定性的差异，在流动相中的溶解性以及与固定相的键合力差异，而在非手性固定相上实现分离。配合剂常用：L-脯氨酸和D-苯丙氨酸。,CLnM+CS CLn-1MCS+CL,适用药物：能与过渡金属离子形成相应配合物 本类药物
9、结构中3、4位上的羧基和酮基极易和金属离子络合。,配合交换手性流动相法（HPLC）,色谱条件,1.0mg/ml,10g/ml,0.2mg/ml,各20l,供试品溶液,40,294nm,硫酸铜-D-苯丙氨酸-甲醇(82:18),C18柱,对照品溶液,进样,氧氟沙星对照品,左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星),判断：供试品溶液色谱图中右氧氟沙星 峰面积不得大于对照溶液主峰面积(1.0%)。,左氧氟沙星中的光学异构体分离图谱 1.右氧氟沙星；2.左氧氟沙星,环丙沙星中有关物质的HPLC检查（略）,五、含量测定,非水 溶液 滴定,紫外法,HPLC法,盐酸洛美沙星 左氧氟沙星,ChP2010吡哌酸的含量采用
10、非水溶液滴定法,ChP2010诺氟沙星乳膏含量 测定采用UV,（一）非水溶液滴定法 喹诺酮类药物具有酸碱两性，而且大部分药物在pH68范围内水溶性不好，不能在水溶液中直接滴定。用非水溶剂将供试品溶解，在溶剂的作用下增强了酸碱性，从而在非水介质中能进行滴定，其中以减量法最常用。,示例,吡哌酸 【含量测定】取供试品约0.2g，精密称定，加冰醋酸20ml溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于30.33mg的C14H17N5O3。,（二）紫外分光光度法 喹诺酮类药物分子结构中具有共轭
11、系统，在紫外区具有特征吸收。又因为具有酸碱两性特征，在酸碱性溶液中皆可溶解，因此可利用紫外分光光度法进行含量测定。,示例,诺氟沙星乳膏【含量测定】精密称取供试品适量(约相当于诺氟沙星5mg)，置分液漏斗中，加三氯甲烷15ml，振摇，用氯化钠饱和的0.1%NaOH溶液25、20、20和10ml分次提取，合并提取液，置100ml量瓶中，加0.1%NaOH溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，用0.4%NaOH溶液稀释制成每1ml中约含5g的溶液，在273nm波长处测定A；另取诺氟沙星对照品适量，精密称定，加0.4%NaOH溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含5g的溶液，同法测定，计算，
12、即得。,（三）高效液相色谱法 喹诺酮类药物是具有胺基和羧基的两性化合物，宜采用离子抑制或离子对色谱法,盐酸洛美沙星含量的戊烷磺酸钠离子对HPLC测定,离子对色谱 外标法,检测波长,287nm,流动相,戊烷磺酸钠溶液 -甲醇(65:35),供试品溶液,约含洛美沙星 （0.1mg/ml） 20 l,对照品溶液,洛美沙星 （1.0mg/ml） 20 l,C18柱,左氧氟沙星含量的高氯酸钠离子对HPLC测定,离子对色谱 外标法,检测波长,294nm,醋酸铵高氯酸钠溶液-乙腈(85:15),流动相,供试品溶液,供试品约60mg,混合对照溶液,左氧氟沙星0.12mg /ml环丙沙星6g /ml杂质E 6g
13、 /ml,C18柱,50ml,取5ml,10l进样,500ml,另取左氧氟沙星对照品适量，同法测定,第二节 磺胺类药物的分析,磺胺类药物的结构通式,母体：对氨基苯磺酰胺,N1,N4,一、化学结构与性质,（一）化学结构,一、代表药物的化学结构,磺胺类药物的分类方法： 1.按N1，N4取代基的不同分类 2.按作用时间的长短分类 3.按作用部位分类,二、理化性质,白色或类白色结晶性粉末。水不溶，溶于稀盐酸或氢氧化钠溶液，易溶乙醇、丙酮。,1.性状,3.酸碱两性,2.熔融变色,不同磺胺类药物以直火加热熔融后，产生不同的分解产物，可呈现不同的颜色。,除磺胺脒外，本类药物显酸碱两性 酸性-磺酰胺基 碱性-
14、芳伯胺基 酸性小于碳酸，因此钠盐水溶液与CO2会析出沉淀。 钠盐注射剂要避免和酸性药物配伍。,磺酰氨基上的氢较活跃，可被金属离子取代，生成不同颜色的金属盐沉淀。,4.芳伯胺基反应,5.磺酰氨基反应,能发生重氮化-偶合反应 易被氧化，在日光和金属离子等催化下，氧化反应能加速进行，因此要避光保存。,6.苯环上的反应,7.N1，N4上取代基的反应,芳伯胺基活化苯环，在酸性条件下可发生卤代反应,N1上取代基常为含氮杂环，与生物碱沉淀试剂反应，溴代。,磺胺甲噁唑草绿色沉淀 磺胺异噁唑淡棕色，放置变暗绿色絮状沉淀 磺胺嘧啶黄绿色沉淀，放置后变为紫色 磺胺多辛黄绿色沉淀，放置后变淡蓝色 磺胺醋酰钠蓝绿色沉淀
15、,三、鉴别试验,（一）金属离子的取代反应,（二）芳香第一胺反应 （磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑和磺胺多辛均具有芳伯氨基 ） （三）钠盐反应 （四）红外分光光度法 （五）高效液相色谱法,四、特殊杂质检查,复方磺胺甲噁唑注射液中磺胺、对氨基苯磺酸和甲氧苄啶降解产物的TLC检查 【检查】 磺胺和对氨基苯磺酸 甲氧苄啶降解产物,HPLC,永停 滴定法,非水 滴定法,五、含量测定,亚硝酸钠滴定法,第三节 体内合成抗菌药物分析,一、水产品中残留喹诺酮类药物的检查,HPLC,LC/MS,放射 免疫,样品前处理方法,提 取,酸性,中性,碱性,乙酸乙酯/乙腈 提取,0.1MNaOH中乙腈 提取,三氯乙酸 甲醇匀浆提取,样品前处理方法,净 化,方 法,固相 萃取法,交替用酸(85%磷酸的氯仿)和/或碱缓冲液,HPLC,GC,GC/MS HPLC/MS,方法,二、水产品中残留磺胺类药物的检查,样品前处理方法,提取方法 样品匀质化后对匀浆进行液-液萃取，提取溶剂有乙酸乙酯、乙腈和甲醇等。 净化方法固相萃取净化（固相萃取柱包括硅胶柱、氧化铝柱、C18柱、氨基柱和离子交换柱等）,三、人血浆中左氧氟沙星浓度测定,取样 除蛋白,萃取离心,氮吹 复溶,HPLC,样品前处理,色谱条件,流速,柱温,荧光检测,C18柱,流动相,1,25,激发295nm 发射440nm,4.6 150mm，5m,
