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1、蛋白质双向电泳及质谱技术,大连理工大学 refine,蛋白质双向电泳技术,双向电泳简介,2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。第一向等点聚焦(IEF) pH梯度载体 pI第二向十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE) SDS作为变性剂和助溶剂 分子量,样品,等点聚焦 (第一向),双向电泳的基本原理与流程示意,分子量,pH 梯度(pI),SDS-PAGE,两性电解质,第二向,双向电泳具体步骤,样品制备 缓冲液的配制 IPG条重泡涨及上样 第一向：IEF IPG条平衡 平衡缓冲液(还原) 平衡缓冲液(巯烷基化) 第二向：SDS-PAGE 胶条染色 成像及图像分析,为什
2、么要进行样品制备,目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。,？,1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。2 最大限度减少样品的损失 低温保存
3、样品(一般需低于-86) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。,样品制备原则,样品制备流程及注意事项,溶解,预处理 (清洗等),破碎,沉淀,按溶解度分级,富集,除杂,样品的破碎,原则最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解样品的来源 易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌,方法,温和,剧烈,温和破碎法,渗透压冲击(培养的细胞) 低渗液中的悬浮细胞反复冻融法(细菌) 液氮冷冻去污剂降解(酵母、霉菌) 降解缓冲液(含尿素和去污剂) SDS(应在IEF前去除)酶降解(植物、细菌、真菌) 溶菌酶(细菌) 纤维素酶，果胶酶(植物) 溶壁酶(酵母),剧烈破碎
4、法,超声破碎(细胞悬浮液) 需以冰冷却避免过热弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物 细胞在剪切力作用下破碎研磨(固体组织，微生物) 液氮中将固体组织磨成细粉末样品研磨器(用于少量样品的处理) 用于精确样品珠磨法(胞悬液，微生物) 通过磨珠研磨破坏细胞壁,作用 去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性关键-可溶性 获得可以重新溶解的蛋白常用方法 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提,样品的沉淀,对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白 硫脲 SDS 新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱),样品中杂质的去除,去除原则 尽量不丢失蛋白 减少蛋白的修饰
5、杂质的主要种类 DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂 其他固体杂质,DNA/RNA的去除,样品中含核酸的不利影响 能被银染色法染色 在凝胶酸性部分产生水平条纹 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀去除方法 蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿),其他杂质的去除,脂质 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀 多糖 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH 盐 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 离子去污剂 如SDS，使蛋白质带负电
6、不能聚焦 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度0.25% 固体杂质 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤,样品的溶解,2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一溶解的目标 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态,增加样品溶解性的手段,变性剂 改变氢键结构，使蛋白
7、疏水中心暴露伸展 尿素、硫尿 表面活性剂 溶解疏水基团 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等 还原剂 使变性蛋白进一步伸展溶解 含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB) 起载体作用的两性电解质 到达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH 捕获样品中少量盐分 浓度应小于0.2（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低),样品液的准备,标准液：,IPG 用两亲性电解液的组成,样品制备注意事项,蛋白质水解 低温 Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 蛋白抑制剂特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离 预分级 窄pH胶(2个pH单
8、位) 强碱性蛋白(如核糖体)的处理 预处理富集 特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦 极端分子量蛋白的处理 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 大于200kD的蛋白，变性为多肽,梯度器,塑料支持膜,固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备,A,C,B,F,E,D,pH 3pH 10,固定pH 梯度(IPG)示意图,聚丙烯酰胺凝胶,COO-,丙烯酰胺单体,R,宽pH梯度及窄pH梯度,宽pH梯度用于：全部蛋白(确定感兴趣蛋白的大致位置)窄pH梯度用于：提高分辨率增加载样能力以检测、分析更多蛋白,IPG 胶的重泡
9、涨及上样,2-DE 样品,重泡涨溶液,重泡涨溶液： 8M 尿素 2% NP-40 或 CHAPS 2% IPG缓冲液 (两亲性电解液) 0.28% DTT 微量 溴酚蓝,IPG 胶条支架,IPG 胶条定位,泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内,蛋白载样量,IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 IPG胶条的pH范围 预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长,第一向：等点聚焦,1. 放置电极垫 (?) 2
10、. 200 V 维持 1.5h 3. 500 V 维持 1.5h 4. 1000 V 梯度上升 1500vh 5. 8000 V 梯度上升 (?) 36000vh,电极垫,IPG 胶条的平衡,平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗 第一步平衡 加DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 第二步平衡 加碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化,使被分离的蛋白质与SDS完整结合,第二向: SDS-PAGESDS 平衡SDS-PAGE,SDS 平衡液 50 mM Tris-HCl 6 M 尿素 30% 丙三醇 2% SDS 微量 溴酚蓝,SDS-PAGE,向电泳缓冲液中加0.5
11、%的琼脂糖,标记纸片,IPG 胶条,胶体考马斯亮蓝染色 灵敏度为30100ng，线性范围是20倍 可实现PAGE的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 胺基黑染色 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 银染 可减少胶内蛋白质产量 对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响,染色方法,银染色,50% 甲醇 25% 乙酸 4h,ddH2O 洗3次 30min/次,0.004% DTT 溶液 30min,0.1% AgNO3 30min,ddH2O 30 sec,3% Na2CO3 0.0185% 甲醛,2.3M 柠
12、檬酸,5% 乙酸 25% 甲醇,负染 主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 速度快（515min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 胶体扩散染料 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色,染色方法,有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料 可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，
13、约3060min完成 灵敏度为210ng其线性范围为3个数量级 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 金属螯合染料 与现代蛋白质组学研究相兼容的 专门与常用微量化学表征过程兼容 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合,染色方法,凝胶的图像处理分析,典型流程凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立,2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白,目前双向电泳需
14、解决的问题,样品的制备及溶解 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白) 载样量的提高 初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 灵敏度及可重复性,对于双向电泳的建议,首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率 第二向采用梯度胶进行分离 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白,蛋白质质谱技术,质谱基础,样品,离子源,质量分析器,离子检测器,固体 液体 蒸汽,形成离子 (带电分
15、子),电离,质量分选(过滤),检测,根据m/z分选离子,数据处理,质谱,检测离子,基本步骤: 1. 样品离子化 2. 根据质量(m/z)不同分离离子 3. 检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图,质谱的评价指标,质量范围 速度 灵敏度 分辨率 精确度,+,+,+,自由漂移区,检测器,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),335 nm,ESI,四级杆质量分析器,碰撞室,反射器,MCP 检测器,碰撞气体,串联质谱法 (MS/MS),ESI-Q-TOF 质谱仪,步骤： 1质量分析2碰撞(离子裂解) 3质量分析,TOF质量分析器,强的抗背景干扰能力 极高的检测灵敏度和准确度 可用来分析复杂混合物中的蛋白质 丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质,串联质谱的优点,1、鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定 鸟枪法蛋白质组学,
