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1、第五章 沉淀,Precipitation（沉淀） Electrical double layer（双电层） 与结晶的区别？,主要内容：,知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。,概述,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处
2、理。 沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。,沉淀法,生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,操作方式,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续
3、法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 首先加入沉淀剂， 沉淀剂的陈化，促进粒子生长； 为离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,沉淀法的分类,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）高价金属离子沉淀法等。 上述各种方法中，除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子，故以下的讨论均限于蛋白质。,第一节 蛋白质表面特性,蛋白质的溶
4、解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,蛋白质表面构成,蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷
5、电区、亲水区和疏水区构成。,蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,沉淀屏障,1、蛋白质周围水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 2、蛋白质分子间的静电排斥作用（存在双电层） 结论：实现蛋白质沉淀可通过降低蛋白质周围水化层和双电层厚度，降低蛋白质溶液的稳定性。,蛋白质胶体溶液的稳定性,蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。 静电斥力 吸引力 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自
6、身基团的电离，因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在，蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。（凝聚）,蛋白表面的双电层（图1）,蛋白表面的双电层（图1）,吸引力,颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。,离子强度与两颗粒间的作用能的关系图,DLVO理论,颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高
7、离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。 虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。,第二节 盐析沉淀,概念,（1）、什么是盐析？蛋白质在高离子强度的溶 液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 Cohn经验方程 （2）、电解质对蛋白质溶解度的影响。 盐溶(salting-in)：电解质浓度低时 盐析（salting-out)：电解质浓度高时,1、中性盐盐析法,早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较
8、满意的结果。 在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。,2、盐析的机理,盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降； 盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降； 盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。,盐析机理（图1）,盐析机理（图2）,3、Cohn方程,现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系（右上） 有时
9、为简单计，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为（右下）,Cohn方程讨论,常数Ks代表图中直线的斜率；代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。 与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关; 从一些实验结果表明，Ks与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。 虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。,蛋白质与离子强度关系图,4、用盐析
10、法分离蛋白质的二种方法,（1）在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度离子强度） （2）在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。（盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）,5、盐析操作,硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂，因为：（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。 硫酸铵的溶解度在030范围内变化很小 20时的饱和浓度约为4.05mol/L（543g/L），饱和溶液密度为(1.235kg/L）
11、 。 用1L水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入761g硫酸铵，饱和溶液体积为1.425L 。,加盐方式,采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入： （1）直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； （2）加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。,盐析沉淀图,不同蛋白质的溶解度曲线,溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b),6、影响因素,盐析行为随蛋白质的相对分子质量和立体结构而异，反映在Cohn方程中就是对和
12、Ks的影响。 主要影响因素有：无机盐的种类、浓度；温度和PH,不同盐溶液中碳氧血红蛋白的S与I的关系（25）,()NaCl； ()KCl； ()MgSO4；()NH4)2SO4；()Na2SO4； ()K2SO4； ()柠檬酸三钠,阴阳离子盐析效果,阴离子盐析效果 ： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ K+Na+ 高价阳离子,pH值和温度的影响,随pH 变化 （1）对数关系 （2）等电点附近有极小值 随温度变化 随温度升高减小，热促失水膜,值随pH值变化,左图表示对卵清蛋白（Ovalbumin）和碳氧血红蛋白进行盐析时，随pH的
13、变化。由于代表溶解度的对数，故 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。通常在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。,温度和PH对盐析曲线的影响,蛋白质起始浓度的影响,二次盐析,可利用二次（多次）盐析（也叫分段盐摩擦的方法，分离不同的蛋白质。,盐析注意事项：,（1）稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度,第三节 等电点沉淀法,概述,在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能
14、使分子间相互吸引，形成沉淀。本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白 在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。 在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。,大豆蛋白的溶解度随pH的变化,特点,（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以
15、提高其沉淀能力。,等电点沉淀实例,（1）从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI=8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI=3.0）。工业生产胰岛素（ pI5.3 ）时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质（同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果） 。 （2）碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入2040%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。,第四节
16、 有机溶剂沉淀法,概述,酶、蛋白质、核酸、多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有机溶剂，它们的溶解度会显著降低，从溶液中沉淀出来。有机溶剂沉淀的优点是：分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。缺点是易使酶变性。,原理,加入有机溶剂使溶液的介电常数减小，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。有机溶剂的加入也使水的极性减小，使两性电解质在溶液中的溶解度降低。有机溶剂会降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 （1）介电常数 （2）溶剂化（蛋白质结合水被取代） （3）疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,有机溶剂沉淀原理图,操作注意事项,使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，以减少蛋白质的变性。 所用的有机溶剂须预先冷却到-10-20； 有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。 中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度，溶液中的中性盐浓度越高，沉淀蛋白质所需要的有机溶剂浓度也越大。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。,
