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1、第十六章 临床电泳分析仪器,最常见的电泳仪,该仪器开展的主要项目有:1、 血清蛋白电泳2、 CK同功酶3 、CK同功酶亚型4、 LDH同功酶5、 AKP同功酶6 、r-GT同功酶7、 脂蛋白电泳8、 血红蛋白电泳 9、 胆固醇电泳10、结合珠蛋白电泳11、免疫固定电泳 12、脑脊液蛋白电泳13、尿液蛋白电泳,蛋白电泳氨基黑染色,胃肠道的蛋白丢失各区带含量均减少，在各种胃肠道功能紊乱时，Alb丢失的同时也伴有球蛋白的丢失。常继发于狭窄性心包炎，先天性肠道林巴管扩张，肠道炎症等。,蛋白电泳丽春红染色,急性烧伤病人的电泳图谱,大面积烧伤病人,其图谱显示Alb、1、显著减少而2明显增加.临床上产生低蛋
2、白血症,其原因:一是血清渗出,二是皮肤丢失,急性肝脏疾病,电泳技术用途-分离、鉴定、纯化,在临床诊断中：血清蛋白，血红蛋白糖蛋白、脂蛋白的分离鉴定和含量的测定，还有血清酶以及免疫化学的检验。它为医生提供了诊断某些疾病的依据如肝炎，肾病等 在科研工作中主要用来提纯蛋白质和蛋白质的结构分析。 电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成分的分离和鉴定，甚至还用于细胞和病毒的研究。,电泳仪的定义电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresi
3、s- technique ）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister) ；,第一节 电泳原理 一、电泳的基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。,蛋白质电泳动画.swf,若溶液里一电量为q的带电粒子，在场强为E的电场中以速度v移动，则它所受到的电场力F1应为：F1 =QE 根据斯托克司定律，在液体中泳动的球状粒子所受到的阻力F
4、2 ，为：F2=6RV 式中为介质的粘度系数，R为粒子半径。当二力平衡，即F1 = F2时，粒子作匀速运动。且有V=QE/6r 从上式可以看出移动速度不仅与本身性质有关，还受到外界因素的影响,影响电泳的因素,（一）电场强度 （二）溶液的pH值（三）溶液的离子强度（四）电渗作用（五）粒子的迁移率（六）吸附作用,一般来说，不同成分的物质，其颗粒本身所带的电量以及颗粒的半径(或摩擦系数)都是不同的，所以它们的迁移率各不相同。利用这一原理即可把物质中各种不同的成分分离开来。例如，血清蛋白中含有各种蛋白质(清蛋白、1, 2 ,球蛋白等)，,电泳分析技术的分类,1、根据电泳电压的高低 常压电泳 高压电泳
5、2、根据电泳中是否使用支持物 自由电泳:在自由溶液中进行的电泳方法 区带电泳:更常用的电泳是将试样放在支持介质（载体）上进行泳动，并在支持介质上形成一个个区带,3、按支持物的物理性状不同,纸电泳 纤维薄膜电泳 如醋酸纤维素电泳凝胶电泳 如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳,4、按支持物的装置形式不同：,平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳,电泳分析仪可分为两大类: 临床实验室常规类,如全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪; 科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳,液相色谱-质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA测序系统。
6、,从目前临床实验室的要求来看电泳仪必须具有下列功能：1.全自动，必须达到人员离机作业，由点样到出报告没有人工动作。2.速度快，所有项目应在60min内完成，同时具备急诊项目，如CK、LD等同工酶及亚型项目。3.项目全，除了血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、CK、LD同工酶等传统项目外，必须还能完成尿蛋白、脑脊液蛋白、免疫固定(单克隆抗体)，碱性磷酸酶(ALP)和s谷氨酰转肽酶(GGT)同工酶、胆固醇(高密度、极低密度低密度脂蛋白)、脂蛋白(a)等最新检验项目。4.灵敏度高，必须采用敏感度高的电泳片，如琼脂糖凝胶系统，才能得到准确度高、分辨率高的电泳结果,第二节 常用电泳技术和电泳方法,一、电泳方法简
7、介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。,06-02 平卧式电泳槽装置示意图,将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V1000V）进行电泳。,（二）醋酸纤维素薄膜电泳电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。,06-03 血清蛋白的电泳图谱,醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白,（三）凝胶电泳由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳
8、的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、 弹性大、透明、化学稳定性高、 无电渗作用、设备简单、 样品量小(1100g）、 分辨率高等优点。这种介质 具有分子筛的作用,06-04 凝胶电泳图,琼脂糖电泳检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用聚丙烯酰胺具有许多优点: 如具有化学惰性；不与试样或其他化学成分起反应；在电泳过程中没有电渗作用和吸附作用； 弹性强，机械强度高；便于操作；透明，便于肉眼观察和用仪器测定；重复性好等。因此聚丙烯酰胺凝胶电泳目前得到广泛应用，如用于蛋白质、核酸等不同大小分子物质的分离和分析。也
9、可测定蛋白质亚基的摩尔质量。可直接应用于临床医学检验中，如测定脑脊液、血、尿、痰和其他体液中的痕量成分。目前多用于离血清蛋白、病毒、酶蛋白等。还可用于分离痕量的蛋白质，,尿蛋白电泳及图谱,（四）等电聚焦电泳1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,06-05 净电荷与PH的关系曲线,等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度
10、，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。,2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度； 由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面； 电泳速度快; 分辨率高; 加入样品的位置可任意选择； 可用于测定蛋白质类物质的等电点; 适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率
11、夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。,06-06 等速电泳示意图,（六）双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。,胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向 等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚
12、丙烯酰胺凝胶上,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,06-07 双向凝胶电泳示意图,(七）免疫电泳免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。,临床上常用的电泳方法有哪些？p212,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,一、常用电泳设备的基本结构 （一）电泳电源 （二）电泳槽 （三）附加装置,06-08 平卧式电泳槽装置示意图,电源,各种电泳槽,附加装置,电
13、泳条带的分析装备,电泳条带的分析装备习惯上，电泳分离后每一片段结果以百分率报告；假如已知总含量，还可以报告计算得到的定量结果。可将电泳片段洗脱后，用分光光度计测定洗脱液；也可用其他分析装备直接对电泳结果进行扫描分析。1光密度扫描仪 光密度扫描仪可对电泳结果直接进行扫描，从而得出相对百分比甚至可以绘制出曲线图，计算出相对面积。光密度扫描仪的主要特性有： 可扫描的电泳支持物长度为25150mm。 可按指令设置对照。 可自动去除一定程度的背景色(设置“基线”)。 有多个波长可选择用于测定(分光计或滤光片),分辨率高 有汇集、处理数据的功能。 由计算机控制的先进的自动电泳仪器所配备的光密度扫描仪可以分
14、析多达约30种不同的电泳条带，有的还可采用荧光法分析电泳条带，这在分析某些同工酶(如CK同工酶等)时十分有用。此外，先进的光密度扫描仪还设计有可供选用的包括自动扫描在内的多种扫描方式和打印装置等，并有质量控制和统计功能，结果可储存和传输。,2其他常用的电泳图谱分析设备 紫外透射反射仪：需在暗室内使用。用于对核酸 片段进行观察。一般入射光为300nm，反射光为254nm和365nm。还有使用方便的手提式紫外反射仪。 双光观察照相仪：可毋需在暗室内操作，对核酸、同工酶和蛋白质的电泳片段进行观察分析和照相记录；254nm、300nm和365nm3个波长可任意选择和组合，使用方便。 照相设备：要求使用
15、分辨力高的照相机和胶卷，并使用聚焦镜头或近拍器。有时还需根据电泳凝胶的颜色，加用不同的滤光片。,3、电泳所需的常用材料 (一)电泳支持物 电泳支持物可分为两类。一类支持物包括滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、琼脂糖等 (二)缓冲液电泳缓冲液中的离子有两个作用：一是使电流得以流动，二是维持一定的pH (三)加样器电泳时加入的样品量应能满足电泳分离要求 (四)染料电泳后可用某种染料对已分离的蛋白质组分进行染色，使之固定并成为肉眼可见的条带。根据支持物或检测需要不同可选择不同染料。常用于蛋白质染色的染料有氨基黑，丽春红，或溴酚蓝。,二、电泳仪的主要技术指标 1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9
16、保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电源频率 7 输出组数 14 功耗,使用方法及注意事项1，使用前应首先阅读仪器说明书，熟悉该机面板上的各旋钮的功能。2连接好电泳槽与电泳仪的连接导线，电源开关置于关闭状态，将调节旋钮逆时针旋到最小值处；稳压稳流选择开关放置在所需要的工作位置。3该机的输出电压和电流均分为两档，选择好档位后，输出范围和电表指示同时转换。4开机后旋转输出调节旋钮，将电压或电流调至所需要的数值。 。,5当使用两个电泳槽时，电压表显示的是加在每个电泳梢两端的电压，电流表指示的是两电泳槽电流之和。6该机设有自动短路保护装置，当输出发生短路时，仪器停止工作3s，然后会自动启 动 7不应将电泳槽放在电源装置上进行电泳。开机后人体不能与电泳槽中的溶液接触；维护、检修时，应先切断电源，以确保安全。,
