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1、实验技术四 革兰氏染色法,一、实验目的学习并初步掌握革兰氏染色法； 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分 类鉴定中的重要性。,二、基本原理,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。用革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：G+ 菌体反应呈深紫色；G-菌体反应呈红色。,二、基本原理,为什么通过革兰氏染色会出现这两种不同反应的细菌呢？这是由这两类细菌的细胞壁的结构和化学成份的不同决定的,三、实验器材,菌种 试剂 其他器材,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,草酸铵结晶紫 、碘液、蕃红、95% 酒精,显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶、擦镜纸等,或枯草杆菌,或沙黄
2、,四、操作步骤,涂片,干燥与固定,草酸铵结晶紫1min,水洗,碘液助染1min,镜检,水洗,95%乙醇脱色20-25s,水洗,蕃红复染1-2min,水洗,干燥,要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性,火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜,滴加结晶紫，以刚好将菌膜覆盖为宜，此时，阳性菌、阴性菌均着上结晶紫的颜色,碘液的助染，使结晶紫和碘在细胞内形成分子量较大的复合物，不易透出细胞壁。,菌体被染成兰紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌,乙醇的作用包括脱水和溶脂作用，G+菌脱色后，细胞透性进一步降低，结晶紫碘复合物不易被抽提出来，而保留在细胞内，复染后仍呈现初染的深紫色；G-菌经乙醇处理后，脂类被溶解加大了孔径和通透性，结晶紫-碘复合物容易被抽提出来，复染后，就着上了蕃红的红色。,思 考 题,1. 制作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？ 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确定你的染色技术操作正确，结果可靠？,
